基于網絡藥理學與分子對接技術探討紅花治療視網膜靜脈阻塞的作用機制研究

裴 超，邵霖霖，劉 晶，施慧彬，馮 俊

中國中醫科學院眼科醫院，北京 100040

視網膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是導致視力下降的主要原因之一，也是僅次于糖尿病性視網膜病變的第二大常見的視網膜血管疾病，主要臨床特征為黃斑水腫、視網膜出血、靜脈迂曲擴張。依據阻塞位置不同，臨床上分為視網膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)和視網膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)兩種主要類型，前者更為多見。流行病學研究表明，全球約1 600萬人罹患RVO，總體發病率為5.20/1 000，其中BRVO的發病率為4.42/1 000，CRVO的發病率為0.80/1 000；而中國(北京地區)10年RVO發病率為1.9±0.1/100[1,2]。高血壓、糖尿病、血脂異常、高同型半胱氨酸血癥等被認為是RVO的危險因素。視網膜靜脈阻塞的確切發病機制尚不完全清楚，可能是靜脈血栓形成的Virchow’s三聯征(即血流動力學變化、血管壁退行性變化及血液高凝狀態)級聯反應的結局[3]。玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物和糖皮質激素類藥物是RVO的主要治療手段，但仍存在藥效短暫、藥物不良反應及病情易反復等問題。

視網膜靜脈阻塞歸屬于中醫學“絡瘀暴盲”范疇，本病基本病機是脈絡瘀阻、血溢絡外，治以“剔絡化瘀、活血利水”為主。紅花是活血祛瘀、通經止痛之要藥，是活血化瘀方劑治療RVO的常用配伍藥味。現代藥理學研究證實，紅花中已分離鑒定化學成分有100多種，包括黃酮類、生物堿、聚炔類及脂肪酸等化合物，具有擴張血管、改善微循環、增加血流量、抗血栓、抗炎、調節免疫等作用[4]。紅花注射液由紅花經水煮醇沉工藝加工而成，具有活血化瘀之功效，主要用于治療閉塞性腦血管疾病，冠心病，脈管炎等疾病[5]。臨床研究表明，紅花注射液治療RVO能夠提高患者的視力，促進眼底出血、滲出的吸收，消退視網膜水腫[6]。紅花治療RVO的物質基礎和活血化瘀功效的科學內涵尚未闡明。

網絡藥理學是系統生物學、藥物化學、藥理學和生物化學等多學科整合的一門新興學科。2007年英國學者HopKins教授在網絡生物學的基礎上提出了“網絡藥理學”概念，其核心思想是通過對基因、蛋白、代謝物互作網絡的多維度、多途徑、多靶點整合調節來揭示藥物作用機制和指導藥物分子設計[7]。網絡藥理學的研究理念與中藥多成分-多靶點-協同調節模式極為契合，為中藥單體或復方活性成分與潛在作用靶點提供了新的視角。分子對接技術是利用計算機技術模擬藥物化合物與疾病靶標之間的幾何結構與空間相互作用，以識別具有治療意義的化合物。本研究旨在通過網絡藥理學探討紅花治療RVO的“多成分-多靶點-多途徑”整體調節的作用機制，同時將預測得到的紅花活性成分與對應作用靶點進行分子對接初步驗證，從而為后續基礎研究提供一定的科學理論依據。

1 方法

1.1 紅花活性成分和作用靶點的收集

從TCMSP數據庫(http://tcmspw.com)中獲取紅花的活性成分和潛在作用靶點，同時結合文獻補充相關化學成分。以“Honghua/紅花”為檢索詞，篩選條件：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-like，DL)≥0.18。然后通過UniProt數據庫(https://www.uniprot.org)，限定物種為“Homo sapiens”，校正所獲取活性成分對應靶點基因名。

1.2 RVO相關疾病靶點的收集

通過GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)和OMIM數據庫(https://omim.org)，以“retinal vein occlusion”為關鍵詞分別進行檢索，剔除重復靶點，獲取RVO相關疾病唯一靶點基因。

1.3 構建疾病-成分-靶點網絡

利用R 3.6.3軟件運行R語言獲取紅花-RVO的交集靶點，通過FunRich 3.1.3軟件繪制Venn圖，利用Cytoscape 3.7.0軟件繪制疾病-成分-靶點網絡。

1.4 構建蛋白互作網絡(protein-protein interactions，PPI)與篩選核心靶點

將“1.3”獲取的紅花-RVO的交集靶點導入String 11.0數據庫(https://string-db.org)，條件設置：限定物種為“Homo sapiens”，最低置信度得分≥0.700，且隱藏離散的網絡節點，得到交集靶點的蛋白互作數據信息。利用Cytoscape 3.7.0軟件的network analyzer功能構建PPI網絡圖和篩選關鍵靶點。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

將1.3獲取的紅花-RVO交集靶點導入Metascape數據庫(https://metascape.org)進行GO功能富集分析(包括生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF))和KEGG通路富集分析，然后依據P<0.05選取排名前10的GO富集分析和排名前15的KEGG通路富集分析結果，利用GraphPad Prism 5.0軟件繪制柱狀圖。

1.6 紅花活性成分和作用靶點的分子對接驗證

選取疾病-成分-靶點網絡中degree值排名靠前的紅花活性成分和PPI網絡中degree值排名靠前的靶點基因進行分子對接。從TCMSP數據庫獲取紅花化學成分的分子結構mol2格式；從RCSB PDB數據庫(https://www.rcsb.org)獲取對應靶點基因的3D分子結構pdb格式。紅花主要活性成分和關鍵靶點基因的分子結構文檔均使用AutoDock Tools 1.5.6軟件轉換為pdbqt格式，利用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行分子對接。通過Pymol 2.3.2軟件將對接得分較高且構象較穩定的化合物與靶點蛋白進行分子對接可視化分析。

2 結果

2.1 紅花活性成分和作用靶點的收集

通過TCMSP數據庫共收集到符合標準的紅花活性成分22個和對應的潛在作用靶點數目367個，利用UniProt數據庫校正靶點基因名，去除無效及重復值，共得到186個作用靶點。

2.2 RVO相關疾病靶點的收集

通過GeneCards數據庫和OMIM數據庫分別獲取RVO疾病靶點數目1 704個，148個；合并且剔除重復值后共得到1 842個。

2.3 構建疾病-成分-靶點網絡

將TCMSP數據庫收集的紅花潛在作用靶點186個和GeneCards數據庫與OMIM數據庫獲取的RVO疾病靶點1 842個，運用R 3.6.3軟件運行R語言得到紅花-RVO交集靶點數目128個，同時利用FunRich 3.1.3軟件繪制Venn圖(圖1)。

圖1 藥物-疾病交集靶點Venn圖Fig.1 Venn diagram of drug-disease intersection targets

將上述所得紅花活性成分與紅花-RVO交集靶點導入Cytoscape 3.7.0軟件繪制疾病-成分-靶點網絡(圖2)，網絡包含145個節點(1種疾病名，1個中藥名，15種中藥活性成分，128個靶點)和404條邊，每條邊表示疾病-藥物所對應靶點、藥物所對應化學成分以及藥物化學成分與潛在作用靶點的相互作用關系。其中槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、黃芩素(baicalein)、β-谷甾醇(beta-Sitosterol)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)這6種活性成分所對應的靶點數目從高到低依次是102、39、35、20、20、16，說明它們可能是紅花的關鍵活性成分(表1)。

圖2 疾病-成分-靶點網絡Fig.2 Disease-component-target network

表1 紅花15種活性成分信息及對應靶點數目Table 1 Information of 15 active ingredients of Carthami Flos and number of corresponding targets

圖3 紅花-RVO交集靶點PPI網絡Fig.3 Carthami Flos-RVO intersection target PPI network

2.4 PPI網絡構建與分析

將“1.3”得到的128個紅花-RVO交集靶點導入String 11.0數據庫獲取蛋白互作數據信息，然后利用Cytoscape 3.7.0軟件構建PPI網絡(圖3)。PPI網絡分析結果，PPI網絡(富集P值<1.0e×10-16)包含128個節點，986條邊，節點的平均度值(degree)為15.4。節點(node)表示蛋白，邊(edge)表示蛋白之間的相互作用關系；度值大小決定節點面積大小，節點面積越大表示蛋白在網絡中所起的作用越大；節點顏色深淺代表節點相互作用程度大小，節點顏色由內向外顏色越淺代表蛋白之間相互作用程度越低。依據節點度值大小，AKT1(58)、IL6(53)、JUN(51)、MAPK1(51)、MAPK8(50)、VEGFA(48)、EGF(42)、CXCL8(41)、MMP9(40)這9個靶點蛋白可能在網絡中起著關鍵作用。

2.5 GO與KEGG富集分析

將128個紅花-RVO交集靶點導入Metascape數據庫分別進行GO和KEGG富集分析(限定物種：Homo sapiens；P<0.05)，共得到GO富集條目2 282個，其中生物過程條目2 000個，主要涉及脂多糖反應、細胞因子介導的信號途徑、細胞外刺激反應、有機環狀化合物的細胞反應、凋亡信號途徑及細胞增殖負性調控等；分子功能條目174個，主要涉及轉錄因子結合、細胞因子受體結合、蛋白同源二聚體活性、蛋白激酶結合、類固醇激素受體活性等；細胞成分條目108個，主要涉及膜筏、囊腔、細胞外基質、RNA聚合酶II轉錄因子復合物、胞質核周區等。共得到167個KEGG富集條目，主要涉及癌癥相關通路、糖尿病并發癥相關AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、VEGF信號通路及p53信號通路等。依據P值篩選排名前10的GO富集分析和排名前15的KEGG富集分析，利用GraphPad Prism 5.0軟件繪制柱狀圖(圖4、圖5)。

圖4 紅花-RVO交集靶點GO富集分析柱狀圖Fig.4 Histogram of GO enrichment analysis of Carthami Flos-RVO intersection targets

圖5 紅花-RVO交集靶點KEGG富集分析柱狀圖Fig.5 Histogram of KEGG enrichment analysis of Carthami Flos-RVO intersection targets

2.6 紅花主要活性成分與對應靶點蛋白的分子對接驗證

運用AutoDock Vina 1.1.2軟件將槲皮素、木犀草素、山柰酚等化合物與AKT1、IL6、JUN、MAPK1、VEGFA等對應靶點分別進行分子對接。一般認為，結合能(Binding energy，kcal/mol)小于-4.25 kcal/mol表示配體小分子與受體蛋白之間有一定的結合活性；結合能小于-5.0 kcal/mol表明配體小分子與受體蛋白之間有較好的結合活性；結合能小于-7.0 kcal/mol表明配體小分子與受體蛋白具有強烈的結合活性。結合能反應受體與配體之間結合的可能性，結合能越低表示受體與配體親和力越高，構象越穩定，說明兩個分子在自然狀態下結合釋放能量越低即更容易結合。分子對接結果提示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇等6種化合物與AKT1、IL6、CXCL8、VEGFA、MAPK1、MAPK8、JUN、MMP9、EGF等9種對應靶點的結合能均小于-5.0 kcal/mol，說明兩者間均有著較好的結合活性。選取槲皮素與IL6(PDB ID:4cni)、槲皮素與VEGFA(PDB ID:3v2a)、木犀草素與MMP9(PDB ID:1l6j)、木犀草素與MAPK1(PDB ID:4iz5)，借助Pymol 2.3.2軟件分別進行分子對接可視化分析(圖6)。分子對接虛擬技術發現，化合物均穩定地位于口袋狀的對接口袋內。槲皮素與活性位點附近的Gln-152、Arg-104、Gln-156、Asp-160這4個氨基酸形成氫鍵結合到IL-6；槲皮素與活性位點附近的Asn-62這1個氨基酸形成氫鍵結合到VEGFA；木犀草素與活性位點附近的Thr-426、Arg-424、Pro-415這3個氨基酸形成氫鍵結合到MMP9；木犀草素與活性位點附近的Lys-54、Ser-153、Met-108、Lys-114這4個氨基酸形成氫鍵結合到MAPK1。

表2 紅花主要活性成分與對應作用靶點的分子對接Table 2 Molecular docking of main active in gredients of Carthami Flos and corresponding targets

圖6 分子對接模式圖Fig.6 Pattern diagram of molecular docking注：A.槲皮素-IL6(PDB ID:4cni)；B.槲皮素-VEGFA(PDB ID:3v2a)；C.木犀草素-MMP9(PDB ID:1l6j)；D.木犀草素-MAPK1(PDB ID:4iz5)。Note:A.Quercetin-IL6 (PDB ID:4cni);B.Quercetin-VEGFA (PDB ID:3v2a);C.Luteolin-MMP9 (PDB ID:1l6j);D.Luteolin-MAPK1 (PDB ID:4iz5).

3 討論

紅花是菊科植物紅花的干燥花，辛，溫，歸心、肝經，具有活血通經，祛瘀止痛之功效。《本草匯言》曰：“紅花，破血、行血、和血、調血之藥也。”說明紅花是活血化瘀之佳品。本研究通過網絡藥理學篩選得到紅花15種活性成分，其中槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇等6種化合物可能是治療RVO的物質基礎，具有抗炎、抗氧化、調節免疫等生物活性。藥理學研究表明，槲皮素對H2O2誘導血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)氧化應激損傷起到修復作用，可能通過激活PI3K/Akt信號通路減輕氧化應激對受損血管的影響，促進血管EPCs增殖和分化[8]。木犀草素具有擴張血管和保護血管的雙重生物活性，可以有效保護血管內皮免受氧化應激損傷[9]。山柰酚能夠抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的人臍靜脈內皮細胞的炎癥反應，說明山柰酚對炎癥狀態下的血管內皮具有保護作用[10]。β-胡蘿卜素對高糖誘導的人臍靜脈血管內皮細胞損傷具有保護作用，可能與抗脂質過氧化作用、誘導NO的生成及促進活性氧的降解有關[11]。

通過疾病-成分-靶點網絡和PPI網絡分析表明，IL6、CXCL8、VEGFA、MMP9、MAPK1、AKT1等可能是紅花治療視網膜靜脈阻塞的關鍵靶點。全身或局部炎癥反應可能是RVO的重要發病機制。IL6是一種重要的促炎細胞因子，通過肌動蛋白微絲重排促進相鄰細胞間縫隙連接的形成，從而增加血管內皮通透性[12]。VEGFA是一種強效、可擴散的內皮特異性有絲分裂原，在缺氧條件下釋放，與血管內皮表達的VEGF受體結合后，可引起視網膜血管內皮細胞緊密連接的構象變化而導致血管通透性增高[13]。臨床研究證實，RVO患者房水中的IL6和VEGF表達水平明顯高于對照組，說明IL6通過誘導VEGF表達上調增加血管通透性，同時也會加重視網膜缺血[14]。CXCL8(即IL8)是參與炎癥細胞募集的趨化細胞因子。伴有黃斑水腫的BRVO患者的玻璃體液內IL8的表達水平明顯高于對照組，提示IL8可能會增加血管通透性和黃斑水腫[15]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一種鈣或鋅依賴性細胞外蛋白水解酶，在各種生理和病理條件下，在降解和重塑細胞外基質中發揮重要作用，尤其是MMP9與多種內皮細胞功能有關，包括增殖、分化和遷移等[16]。RVO患者房水中MMP9的濃度明顯高于白內障對照組，且與視功能損害呈負相關[17]。

GO富集分析結果表明，紅花治療RVO可能通過調控脂多糖反應、細胞因子介導的信號途徑、細胞外刺激反應、凋亡信號途徑及細胞增殖負性調控等生物過程，發揮著抗炎、調節免疫、抑制細胞凋亡等作用。KEGG富集分析結果表明，PPI網絡的關鍵靶點主要富集于糖尿病并發癥相關AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、VEGF信號通路、IL-17信號通路及p53信號通路等炎癥、氧化應激、細胞凋亡等信號途徑。VEGF過度表達導致白細胞淤滯，視網膜血管閉塞及視網膜缺血，同時也可激活NF-κB信號通路，調控下游靶點基因血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)的表達[18]。Long等[19]通過光化學法成功構建實驗性BRVO模型，吸入氫氣可減輕視網膜水腫，縮短血管再灌注時間，改善視網膜功能，證實了吸入氫氣可能激活VEGF信號通路，從而下調VEGFA的表達。IL-17主要由輔助性T細胞產生，IL-17信號通路通過調控IL-6、IL-8、ICAM-1、VEGF的表達，從而促進人視網膜血管內皮細胞的增殖和遷移，誘使毛細血管管腔形成[20]。因此，推測紅花通過NF-κB信號通路、VEGF信號通路、IL-17信號通路等信號通路調控IL-6、IL8、VEGFA等關鍵靶點治療RVO。分子對接結果提示，槲皮素、木犀草素、黃芩素、山柰酚等化合物與IL6、IL8、VEGFA、MMP9、MAPK1等對應靶點結合能均小于-5.0 kcal/mol，提示兩者有著良好的結合活性，說明它們可能是治療RVO的潛在活性成分。

綜上所述，通過網絡藥理學和分子對接驗證提示，紅花通過“多成分-多靶點-多途徑”協同作用治療RVO，發揮抑制炎性反應、抗氧化、調節免疫等作用。鑒于網絡藥理學的局限性，后續基礎研究可以圍繞預測得到的化合物、作用靶點及信號通路作進一步實驗驗證，為中醫藥治療RVO提供可靠的科學內涵。