沉香揮發(fā)油化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展

姚 誠，鐘芙蓉，廖海浪，馬云桐

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137

瑞香科植物白木香(AquilariasinensisLour.Gilg)含樹脂的木材為《中國藥典》2015版收載的中藥沉香；味辛、苦，性微溫，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘[1]。沉香藥用歷史悠久，梁代陶弘景著《名醫(yī)別錄》首次收錄并將其列為“上品”，是沉香化氣丸、沉香降氣散等經(jīng)典方劑的主要組成藥物，被廣泛使用于臨床[2]。

全世界約有19種沉香屬植物，主要分布于中國、印度、老撾、越南、緬甸、印尼、馬來西亞、柬埔寨、菲律賓和巴布亞新幾內(nèi)亞等國家[3]。國產(chǎn)沉香僅有瑞香科白木香一種基原植物,其主產(chǎn)地在海南、廣西和廣東等地。沉香屬植物只有在受到自然因素(雷劈、火燒、微生物入侵等)或人為因素(砍傷、打洞、接菌等)的作用，才有可能在受傷處分泌產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，經(jīng)復(fù)雜的結(jié)香過程后，沉積于木質(zhì)部而形成沉香[4,5]。

沉香含有色酮類、揮發(fā)油類、脂肪酸類和甾體類衍生物等多種化學(xué)成分，其中揮發(fā)油是沉香的主要有效成分群及芳香物質(zhì)。沉香揮發(fā)性成分具有抗氧化、抑菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎及抗癌等多種藥理活性，因?yàn)槠洫?dú)特的香氣，同時(shí)被廣泛用于香水工業(yè)、宗教儀式等領(lǐng)域，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。目前關(guān)于沉香的研究大多集中在其質(zhì)量相關(guān)的2-(2-苯乙基)色酮類化學(xué)成分，對(duì)于揮發(fā)油類活性成分群關(guān)注較少。但研究表明其揮發(fā)性成分具有廣泛的藥理活性，且與品質(zhì)密切相關(guān)。為此，筆者查閱主要是近十余年來沉香國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)其揮發(fā)油類化學(xué)成分的提取方法、化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)行梳理，以期為該類成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 沉香揮發(fā)油不同提取方法比較研究

有效的提取方法是保證沉香揮發(fā)油質(zhì)量和臨床療效的有效渠道。目前沉香揮發(fā)油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、酶輔助提取法、微波輔助法、超臨界CO2流體萃取法、亞臨界水萃取法及固相微萃取法等。

1.1 不同提取方法得油率比較

水蒸氣蒸餾法因其設(shè)備簡單、易操作、低成本和污染小等優(yōu)點(diǎn)，早期被廣泛應(yīng)用于沉香揮發(fā)油的提取。Pornpunyapat等[7]在不同溫度下進(jìn)行水蒸氣蒸餾，發(fā)現(xiàn)沉香揮發(fā)油在高溫(120 ℃)下獲得較高的出油率，品質(zhì)較好且具有更好的物理性質(zhì)，例如顏色較深，香味強(qiáng)度較高，對(duì)人體皮膚的黏附時(shí)間較長等。Chen等[8]利用該法提取三批不同沉香藥材，其精油得率分別為0.042%、0.32%、0.012 8%。但是該提取方法耗時(shí)較長，提取效率低，同時(shí)提取溫度較高，易造成沉香揮發(fā)油中不穩(wěn)定成分的損失。溶劑提取法不僅可以避免熱不穩(wěn)定活性成分的損失(主要是沉香中的特征性成分：2-(2-苯乙基)色酮類化合物)，同時(shí)也具有能耗低、得率高的優(yōu)點(diǎn)。Lin等[9]采用乙醚冷浸法提取三批人工結(jié)香所產(chǎn)沉香揮發(fā)油，其得油率分別為9.7%、1.8%、2.9%。但是該提取方法存在溶劑用量大且難以去除殘留的提取溶劑等缺點(diǎn)。

隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)及相關(guān)學(xué)科技術(shù)的迅猛發(fā)展，一些輔助提取技術(shù)逐漸興起。酶輔助提取可在溫和的條件下使細(xì)胞內(nèi)有效成分充分溶解，是近年出現(xiàn)的一種新型植物精油提取方法。Gong等[10]對(duì)經(jīng)過纖維素酶預(yù)先處理的沉香進(jìn)行精油提取，發(fā)現(xiàn)提取得率可達(dá)到1.621%，與未添加纖維素酶處理的樣品相比，沉香揮發(fā)油提取得率增加了257%。微波輔助提取法利用微波加熱打破植物的細(xì)胞壁，使揮發(fā)油溶出，可以加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間及有效提高得油率。Chen等[11]采用動(dòng)態(tài)-微波輔助法對(duì)市售沉香進(jìn)行精油提取，得率為0.68%。除上述沉香揮發(fā)油新型提取方法外，近年還出現(xiàn)了一些處于探索研究階段的其他新型提取方法，如超臨界流體萃取法[12]、亞臨界流體法萃取法[13]和固相微萃取法[14,15]等技術(shù)。這些新型提取方法具有提取時(shí)間短、效率高且質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)，但是大多成本昂貴，不適于大規(guī)模實(shí)際生產(chǎn)。

1.2 不同提取方法所得揮發(fā)油的組分及含量比較

研究表明，不同提取方法提取的沉香揮發(fā)油類化學(xué)成分在含量、組成上存在一定差異。表1總結(jié)了沉香揮發(fā)油提取方法相關(guān)研究中代表性文獻(xiàn)的結(jié)論。發(fā)現(xiàn)水蒸氣蒸餾法提取的化學(xué)成分多是相對(duì)分子質(zhì)量較小且遇熱結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的倍半萜類成分，而超臨界CO2萃取法由于萃取過程短、溫度低等特點(diǎn)所得成分以相對(duì)分子質(zhì)量大且遇熱不穩(wěn)定的成分居多，能提取出更多的色酮類成分。微波輔助萃取和溶劑提取法能夠得到較為豐富的芳香族類化合物。酶輔助提取法盡管增加了細(xì)胞內(nèi)揮發(fā)性成分的溶出和節(jié)省提取時(shí)間，但同時(shí)使得脂肪酸及脂肪酸衍生物的含量較高，降低了精油質(zhì)量。相對(duì)而言，亞臨界流體法萃取沉香揮發(fā)油所得成分豐富，且特征呈香性成分提取率較高，對(duì)于沉香精油的制備有著獨(dú)特優(yōu)勢。綜合來看，為有效獲得高品質(zhì)的沉香揮發(fā)油，多種提取方法聯(lián)用以實(shí)現(xiàn)提取效率的最大化，將是未來沉香揮發(fā)油提取工藝發(fā)展的方向。

2 沉香揮發(fā)油化學(xué)成分研究

沉香揮發(fā)油香氣濃烈且成分復(fù)雜，是沉香主要次生代謝產(chǎn)物。近年來多采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)進(jìn)行成分分析研究。沉香揮發(fā)油中的主要活性成分是倍半萜化合物和芳香族化合物，與沉香的香味和品質(zhì)息息相關(guān)[20,21]。

2.1 沉香揮發(fā)油化學(xué)成分的骨架類型

2.1.1 倍半萜化合物

倍半萜類化合物在沉香揮發(fā)油中廣為存在，是主要的活性成分，按骨架可以分為沉香呋喃型(agarofurans)、沉香螺旋烷型(agarospiranes)、桉烷型(eudesmanes)、艾里莫酚烷型(eremophilanes)、愈創(chuàng)木烷型(guaianes)、杜松烷型(cadinanes)和前香草烷型(prezizanes)[22]。國內(nèi)外研究人員已經(jīng)相繼對(duì)沉香揮發(fā)油中的倍半萜類成分進(jìn)行一定的研究。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)不完全統(tǒng)計(jì)，沉香中的倍半萜類化合物迄今已分離并鑒定出180余種[23-25]。目前，隨著提取分離技術(shù)和檢測設(shè)備的不斷優(yōu)化升級(jí)，更多新成分被發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)。筆者主要對(duì)自2010年以來國內(nèi)外研究中新分離鑒定沉香揮發(fā)油中的倍半萜類成分(1～74)[26-47]進(jìn)行歸納總結(jié)，共有74種化合物。其骨架類型、名稱見表2，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

表1 不同提取方法沉香揮發(fā)油中的化學(xué)成分及含量Table 1 Chemical components and contents of volatile oil of Agarwood by different extraction methods

表2 近年分離發(fā)現(xiàn)的沉香中的倍半萜類化合物Table 2 Sesquiterpenoids in agarwood isolated in recent years

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖1 沉香揮發(fā)油中倍半萜類化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of sesquiterpenoids in volatile oil of agarwood

2.1.2 芳香族化合物

芳香族類化合物是沉香中的另一類特征成分，在沉香揮發(fā)油中所占比例較小。1998年，Yang等[48]從沉香中分離得到芐基丙酮(75)、對(duì)甲氧基芐基丙酮(76)和茴香酸(77)。近年來，Mei等[49]應(yīng)用GC-MS分析技術(shù)測定國產(chǎn)沉香揮發(fā)油化學(xué)成分，報(bào)道發(fā)現(xiàn)了2，4-二叔丁基苯酚(78)和苯基丙酸(79)。Lin等[9]采用乙醚浸提法在3種人工結(jié)香法所產(chǎn)沉香的揮發(fā)性成分中檢測到苯甲醛(80)、3-苯基-2-丁酮(81)、4-甲基-2,6-二叔丁基苯酚(82)和3，5-二叔丁基苯酚(83)。Chen等[50]發(fā)現(xiàn)三氯甲烷能有效提取出沉香揮發(fā)油中的芳香族類化合物，從中得到苯甲酸(84)、4-甲氧基-苯甲醛(85)、2-甲基-萘(86)、苯丙酸(87)、香草醛(88)、3-(4-甲氧基苯基)丙酸(89)、4-羥基-3,5-二甲基苯甲醛(90)和4-羥基-3-甲氧基苯丙酸(91)。Li等[3]從國產(chǎn)人工打洞沉香的乙酸乙酯提取物中分離鑒定出3個(gè)揮發(fā)性芳香族化合物：3-羥基-4-甲氧基苯丙酸甲基酯(92)、姜油酮(93)和對(duì)甲氧基苯丙酸(94)。化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

2.2 沉香揮發(fā)油分級(jí)主要標(biāo)志化合物

傳統(tǒng)上沉香揮發(fā)油等級(jí)的分類是人為的依據(jù)顏色和氣味等物理感覺，但無法處理大量樣品，且存在主觀性強(qiáng)、重復(fù)性差等缺點(diǎn)，使得沉香揮發(fā)油的質(zhì)量分級(jí)難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化[25]。隨著對(duì)沉香揮發(fā)油化學(xué)成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)倍半萜類和芳香族化合物在一定程度上可以決定沉香揮發(fā)油的品質(zhì)，作為質(zhì)量分級(jí)的標(biāo)志化合物。

圖2 沉香揮發(fā)油中芳香族類化合物結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of aromatic compounds in volatile oil of agarwood

在現(xiàn)代分級(jí)體系中，多種分析技術(shù)與統(tǒng)計(jì)方法相結(jié)合是實(shí)現(xiàn)沉香揮發(fā)油分級(jí)的重要手段[23]。比如利用GC-MS分析技術(shù)結(jié)合K最近鄰(k-Nearest Neighbor)法[51]、Z-score標(biāo)準(zhǔn)化[52]和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)[53]等近年較為流行的算法，研究人員實(shí)現(xiàn)了沉香油品質(zhì)的分級(jí)，準(zhǔn)確率高達(dá)83%以上，且發(fā)現(xiàn)10-epi-γ-eudesmol(95)、β-agarofuran(96)、α-agarofuran(97)、γ-eudesmol(98)、longifolol(99)、oxo-agarospirol(100)、hexadecanol(101)和eudesmol(102)在沉香揮發(fā)油中含量相對(duì)較高且穩(wěn)定，可以作為沉香油分類的標(biāo)志化合物。直接熱脫附法(direct thermal desorption，DTD)，是近年新興的一種獲取香氣成分的方法，節(jié)省樣品且效率高，Ismail等[54]利用此法提取不同等級(jí)沉香的揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)α-guaiene(103)、β-selinene(104)、guaia-1(10),11-dien-15-al(105)和guaia-1(10),11-dien-15,2-olide(106)對(duì)于沉香油品質(zhì)分級(jí)具有重要意義。Tajuddin等[55]采用氣相色譜-火焰離子化檢測器(GC-FID)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)沉香揮發(fā)油成分進(jìn)行化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)jinkoh-eremol(22)、kusunol(107)和selina-3,11-dien-9-one(108)可作為沉香油的分類標(biāo)志化合物。Pripdeevech等[56]采用固相微萃取法提取沉香揮發(fā)性成分，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-嗅聞技術(shù)對(duì)萃取成分進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)4-phenyl-2-butanone(75)、furfural(109)和benzaldehyde(80)3種芳香族化合物是沉香精油中主體香氣成分。此外研究發(fā)現(xiàn)caryophellene oxide(110)、α-copaene(111)、β-guaiene(112)、α-bulnesene(113)、valencene(114)和aromadendrene(115)也是重要的沉香揮發(fā)油分級(jí)的標(biāo)志化合物[57-59]。化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3。

近年來劉昌孝院士提出關(guān)于中藥質(zhì)量控制標(biāo)志物的新概念[60]，明確指出質(zhì)量標(biāo)志物是中藥材及中藥產(chǎn)品具有特異性的、固有存在的有效化學(xué)成分，可作為質(zhì)量控制鑒定及臨床用藥有效性、安全性的評(píng)價(jià)依據(jù)。通過對(duì)沉香揮發(fā)油標(biāo)志化合物的研究，筆者認(rèn)為可以為今后沉香揮發(fā)油質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測分析提供有益參考。

3 沉香揮發(fā)油的藥理活性

沉香在醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)利用方面有較大潛力，與其揮發(fā)油廣泛的藥理作用密切相關(guān)。研究表明沉香揮發(fā)香油具有抗氧化、抑菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎和抗癌等多種藥理活性。

3.1 抗氧化、抑菌作用

研究表明，沉香揮發(fā)油具有顯著的抗氧化、抑菌作用。Xiong等[61]研究發(fā)現(xiàn)沉香揮發(fā)油在一定程度上能減少細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px的活力，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。Wang等[62]通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除和鐵離子還原/抗氧化能力法(FRAP)測定沉香精油抗氧化活性，結(jié)果顯示具有較好的體外抗氧化能力。抗菌活性試驗(yàn)表明，沉香精油對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有較好抑制效果，且對(duì)革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)的抑菌作用較明顯。Dahham等[63]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)沉香揮發(fā)油中的倍半萜類化合物β-石竹烯具有顯著的抗氧化、抗菌性能。

圖3 沉香揮發(fā)油中主要標(biāo)志化合物結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of main marker compounds in volatile oil of agarwood

3.2 鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用

沉香在傳統(tǒng)中藥中作為行氣藥，具有行氣止痛功效。Wang等[64]比較不同年份沉香藥材的鎮(zhèn)痛作用，研究發(fā)現(xiàn)沉香揮發(fā)油可顯著提高小鼠痛閾值和降低醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的扭體發(fā)生次數(shù)，證明其具有明確的鎮(zhèn)痛作用。Wang等[65]通過協(xié)同戊巴比妥鈉催眠實(shí)驗(yàn)和自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了沉香不同部位在鎮(zhèn)靜催眠方面的藥效學(xué)作用，發(fā)現(xiàn)沉香揮發(fā)油能顯著延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時(shí)間及增加閾下劑量小鼠進(jìn)入睡眠的比例，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步推斷沉香揮發(fā)油中具有鎮(zhèn)靜催眠作用的活性分子可能為弱極性分子。Wang等[66]通過動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)沉香精油的鎮(zhèn)靜催眠作用，探討對(duì)GABA能系統(tǒng)的潛在作用機(jī)制，結(jié)果表明沉香揮發(fā)油具有顯著的鎮(zhèn)靜催眠作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)GABAA受體的基因表達(dá)，增強(qiáng)GABAA受體功能，促進(jìn)Cl-1內(nèi)流有關(guān)。

3.3 抗炎作用

體內(nèi)和體外抗炎活性實(shí)驗(yàn)均表明沉香揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗炎活性[67]。Gao等[68]研究發(fā)現(xiàn)沉香精油灌胃給藥具有顯著的抗炎活性，通過脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞模型和Western blot方法發(fā)現(xiàn)其抗炎信號(hào)通路可能是通過抑制p-STAT3的表達(dá)，進(jìn)而降低前炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的產(chǎn)生和釋放，同時(shí)結(jié)合化學(xué)成分的分析結(jié)果推斷與其主要成分倍半萜類有關(guān)。Zhao等[37]從沉香95%乙醇提取物中分離得到7個(gè)倍半萜類化合物，研究發(fā)現(xiàn)化合物1,10-dioxo-4αH-5αH-7βH-11αH-1,10-secoguaia-2(3)-en-12,8β-olide具有明顯的抗炎活性，其IC50值為8.4 μmol/L。Yadav等[69]研究發(fā)現(xiàn)沉香精油可顯著減少TPA誘導(dǎo)的小鼠耳炎癥模型中小鼠耳厚度、耳重量和降低MDA水平及促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，推測其抗炎機(jī)制可能與抑制促炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的水平和降低機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度(MDA)有關(guān)，同時(shí)通過分子對(duì)接研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)倍半萜類化合物jinkoh-eremol和10-epi-γ-eudesmol具有較強(qiáng)的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性。這些研究結(jié)果初步闡明了沉香揮發(fā)油抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)及相關(guān)作用機(jī)制，證明其可以作為治療炎癥疾病的有效藥物。

3.4 抗癌作用

此外，沉香揮發(fā)油還具有一定的抗腫瘤作用。Hashim等[70]對(duì)沉香揮發(fā)油進(jìn)行了細(xì)胞活力、細(xì)胞附著度和細(xì)胞毒性的測定，確定了其IC50值為900 g/mL，結(jié)果表明沉香精油對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞具有潛在的抗癌活性。Ibrahim等[71]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉香精油對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗癌活性，是治療結(jié)腸癌的良好選擇。此外Dahham等[72-74]研究了沉香揮發(fā)油對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和胰腺癌細(xì)胞MIAPaCa-2的抑制活性，發(fā)現(xiàn)均有顯著的抑制作用，并推測沉香揮發(fā)油的抗癌作用可能是由于多種生物活性成分協(xié)同作用所致。

3.5 其他作用

Wang等[75]通過一系列的動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)，證明了沉香揮發(fā)油具有抗焦慮和抗抑郁作用，推測可能與抑制促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)和下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的過度活動(dòng)有關(guān)。Rahman等[76]采用吸入途徑對(duì)小鼠給藥，研究發(fā)現(xiàn)沉香精油具有一定的抗焦慮作用。在胃腸道調(diào)節(jié)作用方面，有研究發(fā)現(xiàn)[77,78]，沉香揮發(fā)油中的主要活性化合物芐基丙酮具有增強(qiáng)食欲的作用。此外，沉香揮發(fā)油還有降血糖[79,80]、抗心肌缺血[81]等藥理活性。

4 總結(jié)與展望

沉香藥用歷史悠久、療效確切，是我國傳統(tǒng)珍貴中藥材。其揮發(fā)油作為香氣的主要來源和主要活性部位群，所含化學(xué)成分種類多樣且藥理作用廣泛，具有廣闊的開發(fā)利用前景。近年來隨著現(xiàn)代提取分離技術(shù)的飛速發(fā)展，不同提取方法所得沉香揮發(fā)油提取率和成分種類含量有較大差別。目前從沉香揮發(fā)油中分離得到的化合物主要包括倍半萜類、芳香族類等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，沉香揮發(fā)油具有抗氧化、抑菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗癌等多種藥理作用，具有良好的臨床應(yīng)用與新藥研發(fā)價(jià)值。

然而，現(xiàn)代沉香品質(zhì)評(píng)價(jià)研究主要集中在特征化學(xué)成分色酮類，對(duì)主要活性成分揮發(fā)油關(guān)注較少，對(duì)沉香揮發(fā)油整體質(zhì)量控制的研究相對(duì)薄弱。筆者通過對(duì)沉香揮發(fā)油的提取方法、化學(xué)成分以及藥理活性進(jìn)行總結(jié)，有助于建立沉香揮發(fā)油質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。同時(shí)通過對(duì)揮發(fā)油中主要標(biāo)志化合物進(jìn)行總結(jié)，能夠?yàn)槌料銚]發(fā)油質(zhì)量標(biāo)志物的篩選和確定提供參考方向，具有指導(dǎo)意義。這將有助于后續(xù)深入挖掘沉香揮發(fā)油的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和臨床用藥奠定研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。