外源GDF11對人主動脈內皮細胞鈣化的影響

盛 瑛，張宸銘，陳 亮，徐佰達，靳天慧，劉葉紅，葉 挺，宗剛軍,

血管鈣化是糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病在血管方面的特征性病理改變。一旦血管鈣化發生，將導致血壓波動、斑塊破裂、血栓形成等嚴重后果[1-2]。研究[3]表明，血管鈣化與平滑肌細胞或內皮細胞的成骨轉分化、炎癥、凋亡或外泌體的釋放均緊密相關。鈣化發生時主要表現為成骨轉錄因子Runx2、Osterix及其下游成骨相關蛋白，如骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、BMP4、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等的表達增加[4]。目前，有關轉錄生長因子-β(transform growth factor-β，TGF-β)家族的BMP2、BMP4、BMP6促進血管鈣化的研究較多，但尚未見同家族的生長分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)在鈣化方面的報道。有研究[5-6]表明，補充外源性GDF11可逆轉高齡小鼠因老化導致的心臟、骨骼肌、腦血管疾病。還有研究發現，GDF11可以促進破骨、抑制成骨分化過程[7]。該研究擬用β-甘油磷酸、地塞米松、L-抗壞血酸誘導人主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cell，HAEC)鈣化，探究外源GDF11對鈣化及其過程中成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料HAEC購自上海子實生物科技公司，以該細胞為研究對象，通過倫理委員會批準。內皮細胞基礎培養基(endothelial cell medium，ECM)、內皮細胞生長因子(endothelial cell growth supplement，ECGs)、胎牛血清均購自美國Sciencell公司；胰蛋白酶、細胞裂解液購自北京碧云天公司；人源外源重組GDF11因子購自美國Peprotech公司；一抗BMP2、BMP4、GDF11均購自美國Abcam公司；內參蛋白β-actin購自美國ABSCI公司；二抗兔、FITC標記熒光二抗兔均購自杭州聯科生物技術公司；HRP標記二抗鼠購自美國CST公司；引物Runx2、Osterix、GAPDH、GDF11購自上海吉瑪生物科技公司；基因檢測熒光染料SYBR、逆轉錄酶購自南京Vazyme公司。

1.2 細胞培養使用內皮細胞完全培養基(ECM+ECGs+5%胎牛血清)，于5% CO2的37 ℃恒溫孵箱中培養，每2 d更換培養液，細胞長至培養表面70%～80%時，進行消化傳代，取3～5代細胞進行實驗，以1×105/ml的細胞數密度種植于六孔板。

1.3 方法

1.3.1建立HAEC鈣化模型 以β-甘油磷酸為研究變量，進行分組實驗，分為空白對照組、低濃度組、高濃度組。空白對照組常規培養10 d；低濃度組予10 mmol/L β-甘油磷酸+100 nmol/L地塞米松+50 μg/ml L-抗壞血酸培養10 d；高濃度組予30 mmol/L β-甘油磷酸+100 nmol/L地塞米松+50 μg/ml L-抗壞血酸培養10 d。

1.3.2實驗分組 以GDF11為變量，探討外源重組GDF11干預HAEC鈣化的有效濃度及時間：① GDF11預處理48 h，按濃度梯度分為5組：空白組、鈣化組、30 ng/ml組(30 ng/ml GDF11)、50 ng/ml組(50 ng/ml GDF11)、100 ng/ml組(100 ng/ml GDF11)；② 以100 ng/ml GDF11干預，按時間梯度分5組： 空白組、鈣化組、8 h組、24 h組、48 h組；③ 篩選出GDF11有效干預濃度與時間后，HAEC分4組進行后續實驗：空白組(常規培養12 d)、GDF11組(予100 ng/ml GDF11預處理48 h、再常規培養10 d)、鈣化組(常規培養2 d后，予鈣化誘導10 d)、GDF11+鈣化組(予100 ng/ml GDF11預處理48 h，再鈣化誘導10 d)。

1.3.3Western blot 檢測BMP2(1 ∶1 000)、BMP4(1 ∶1 000)、GDF11(1 ∶2 000)、內參蛋白β-actin(1 ∶3 000)。收集樣本，提取總蛋白，于 80 V恒壓電泳40 min左右，待marker分開后，調至120 V恒壓電泳至上樣緩沖液脫落， 350 mA恒流轉膜80 min，5%BSA封閉1 h，孵育一抗(4 ℃過夜)，TBST洗膜5 min 5次，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜5 min 5次，滴加ECL曝光液進行顯影，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin的比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.3.4RT-PCR 檢測Runx2、Osterix、GDF11、GAPDH基因表達水平。鈣化誘導10 d后，收集細胞提取RNA，測RNA濃度，按Vazyme逆轉錄和定量試劑盒說明書進行逆轉錄和定量檢測。引物序列見表1。

1.3.5茜素紅S染色 4%多聚甲醛中室溫固定細胞30 min，用PBS洗5 min 3次，pH 4.2的2%茜素紅S浸染爬片10 min，立即用PBS快速沖洗，直至洗液不變紅，用封片劑封片，于鏡下觀察。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1 HAEC鈣化模型的建立及鈣化后內源GDF11表達的影響Western blot結果顯示(圖1)，高濃度組的BMP2、BMP4、GDF11蛋白相對表達水平均高于空白對照組(P<0.05)；RT-PCR結果顯示(圖2)，高濃度組Runx2、Osterix、GDF11的相對基因表達水平均高于空白對照組(P<0.05)；茜素紅S染色結果顯示(圖3)，高濃度組的鈣化沉著高于空白對照組及低濃度組；細胞免疫熒光結果顯示(圖4)，高濃度組的GDF11熒光強度高于空白對照組及低濃度組。后續實驗中鈣化組即高濃度組的誘導方案。

圖1 Western blot 檢測各組HAEC內GDF11、BMP4、BMP2蛋白表達水平

圖2 RT-PCR檢測各組HAEC內Runx2、Osterix、GDF11基因表達水平

2.2 外源GDF11對HAEC鈣化有效作用濃度和時間Western blot結果顯示(圖5)，100 ng/ml組BMP2 、BMP4蛋白低于鈣化組(P<0.05)，24 h組BMP2 、BMP4蛋白低于鈣化組(P<0.05)，24 h組與48 h組比較差異無統計學意義，后續GDF11+鈣化組均以100 ng/ml GDF11預處理48 h作為GDF11有效干預濃度和時間。

2.3 外源GDF11對鈣化相關蛋白及鈣化沉積的影響Western blot結果顯示(圖6)，GDF11+鈣化組BMP2、BMP4相對蛋白表達水平均低于鈣化組(P<0.05)，但GDF11組BMP2、BMP4蛋白表達水平與空白組比較差異無統計學意義；茜素紅S染色顯示(圖7)，GDF11+鈣化組鈣化沉積較鈣化組減少。

2.4 外源GDF11對鈣化的HAEC核內成骨轉錄因子Runx2、Osterix的影響RT-PCR結果顯示(圖8)，與鈣化組比較，GDF11+鈣化組Runx2、Osterix基因表達水平均下降(P<0.05)，GDF11組Runx2、Osterix基因表達水平與空白組比較差異無統計學意義。

圖3 各組HAEC鈣化沉著的茜素紅染色結果 ×400A:空白對照組；B:低濃度組；C:高濃度組； 箭頭指示粉紅色附著處為鈣化沉積

圖4 各組HAEC細胞免疫熒光染色結果 ×200

圖5 Western blot檢測各組HAEC經不同濃度、時間外源GDF11預處理后BMP2、BMP4蛋白表達水平

3 討論

血管鈣化是由內皮細胞、間質細胞、免疫細胞等相互作用，機械損傷、炎癥、新陳代謝、信號轉導等所支配的骨質礦化的復雜過程[8]。血管內皮細胞作為血管的最內層結構，最易受血流沖擊引起機械損傷及炎癥反應。其次內皮細胞與血液直接接觸，是多種分子的靶細胞，最易受到各種分子的作用。有研究[9-10]指出主動脈瓣膜內皮細胞可分泌一氧化氮和C型尿鈉肽，從而調控瓣膜間質細胞生長分化，抑制間質細胞鈣化。血管平滑肌細胞是血管間質成分的一種，亦受內皮細胞分泌物質的調控。因此，研究動脈內膜的鈣化具有更顯著的現實意義。有研究表明高磷或高糖環境促進HAEC成骨分化是血管鈣化機制之一[11-12]，所以抑制內皮細胞向成骨分化的過程是抑制內膜鈣化的重要機制之一，選取HAEC為研究對象，并對其鈣化進程中所發生的成骨分化展開研究，具有重要的臨床意義。

圖6 Western blot檢測各組HAEC內BMP2、BMP4蛋白表達水平

圖7 茜素紅S染色檢測各組HAEC鈣化沉積 ×400

圖8 RT-PCR檢測各組HAEC內Runx2、Osterix相對基因表達(n=3)

本研究中鈣化模型不同于以往已報道的是，既往常用10 mmol/L β-甘油磷酸誘導血管平滑肌細胞鈣化[13]，而HAEC需用更高濃度β-甘油磷酸(30 mmol/L)才能發生顯著鈣化。誘導HAEC鈣化后，BMP2、BMP4蛋白表達上調，其上游的成骨轉錄因子Runx2、Osterix表達也上調，說明該鈣化誘導方案可能經Runx2/Osterix途徑[14]。在該鈣化模型中，GDF11的蛋白和基因表達同時上調。而目前研究[15-16]內源GDF11表達者多聚焦于臨床范疇，且尚無統一結論，可能與不同細胞系、不同疾病、年齡、GDF11的檢測方法等混雜因素有關[17-18]。但鈣化誘導后所表現的GDF11升高是負反饋性上調抑制鈣化還是僅作為一種促鈣化標記物正反饋性上調不得而知。本研究便在鈣化誘導之前補充外源GDF11因子，發現BMP2、BMP4均下調；另外，外源GDF11也下調鈣化過程中的Runx2、Osterix基因表達水平。茜素紅染色提示GDF11從大體層面抑制了鈣化的發生，以上結果表明GDF11可能通過Runx2/Osterix途徑來抑制鈣化。鈣化組的GDF11表達雖上調，但鈣化相關蛋白并未下調，說明高甘油磷酸誘導鈣化所致內源GDF11的上調并不能抑制鈣化的發生，在補充一定濃度的外源GDF11后可見鈣化相關蛋白下調，鈣化沉積也減少。可能因為內源GDF11的濃度不足以抑制鈣化或外源GDF11通過反饋性抑制內源GDF11的表達來抑制鈣化。

研究表明高濃度β-甘油磷酸、地塞米松、L-抗壞血酸可誘導HAEC鈣化，可能通過成骨轉錄因子Runx2/Osterix正性調節下游鈣化蛋白的表達，為后續研究奠定了基礎。并發現外源GDF11可能通過Runx2/Osterix途徑抑制HAEC鈣化，本研究證實GDF11在體外可抑制HAEC鈣化的進展，為血管內膜鈣化的治療提供了干預的靶點，但具體機制尚待進一步研究。