ATG5介導內皮細胞外泌體調控平滑肌細胞增殖

李征遠，胡 培，周 琳，單勐也，郭興榮

心血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的常見病，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點[1]。全世界每年死于心血管疾病的人數高達1 500萬，居各種死因首位[2-3]。冠狀動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病可導致血管重構，而血管平滑肌細胞增殖和遷移是引起血管重構的重要因素之一，也是一些心血管疾病發生與發展的關鍵始動因素之一[4-10]。相關研究[11-13]發現，血管內皮細胞來源的外泌體水平升高可誘導血管生成。而自噬相關蛋白ATG5在外泌體形成中發揮重要作用[14-15]，但ATG5、內皮細胞外泌體及平滑肌細胞增殖之間的關系尚不明了。因此，該研究通過siRNA干擾內皮細胞ATG5蛋白的合成，研究其所產生的外泌體對平滑肌細胞增殖的影響，探討ATG5介導下的內皮細胞與平滑肌細胞之間的信息傳遞，并利用共聚焦高內涵成像分析儀示蹤平滑肌細胞攝取外泌體的過程。

1 材料與方法

1.1 實驗材料新生兒臍帶由湖北醫藥學院附屬太和醫院婦產科產婦自愿捐贈，Ⅱ型膠原酶、DMEM/F-12 培養基以及胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、DAPI以及cy3/FITC標記的熒光二抗購自武漢碧云天生物技術有限公司，FactorⅧ、CD31、Pan-Cadherin、SM22-α和α-actin抗體購自北京博奧龍免疫技術公司；Hsp70、CD9、CD63、TSG101抗體購自美國Proteintech公司；外泌體于武漢谷歌生物科技有限公司進行電鏡鑒定；PKH67 MINI67-1KT購自美國Sigma公司，siRNA及轉染試劑購自廣州銳博生物科技有限公司；CO2培養箱、SORVALL MX150+超高速離心機購自美國Thermofisher公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus有限公司，共聚焦高內涵成像分析儀購自美國PerkinElmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1人臍帶靜脈內皮細胞的分離 20 cm健康足月剖腹產新生胎兒臍帶收集于湖北醫藥學院附屬太和醫院婦產科，在無菌條件下用 PBS 沖洗干凈，分離臍帶中管壁薄、腔略大的臍靜脈。用去掉針頭的無菌注射器和 PBS 沖洗臍靜脈管腔，直至流出液澄清。用止血鉗夾閉臍帶一端，從另一端灌注0.1% Ⅱ型膠原酶至臍靜脈充盈，并用止血鉗封閉臍靜脈，37 ℃消化30 min，收集消化液至等體積含有10% FBS的DMEM/F-12培養基中，混勻后將收集液1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用含10% FBS 的 DMEM/F-12 培養基重懸后再次離心，棄上清液，加入完全培養基(10% FBS+DMEM/F-12+100 μg/ml青霉素+100 μg/ml 鏈霉素)制成細胞懸液。將細胞懸液接種至25 cm2的細胞培養瓶中，置于5% CO2、37 ℃培養箱中靜置培養，24 h 后觀察細胞貼壁狀況并更換培養液，以后每隔1～2 d換液。

1.2.2小鼠胸主動脈平滑肌細胞的分離 將SD小鼠斷頸處死，在無菌條件下取其胸主動脈，清除結締組織，完整剝離動脈外膜并縱向剖開血管，將血管內膜向上平鋪于細胞培養皿中，刮除內膜并將其剪成約1 mm2的小組織塊，以0.5 cm的間距將組織塊分布于25 cm2細胞培養瓶底部，輕輕翻轉培養瓶使瓶底朝上并注入4 ml完全培養基(20% FBS+DMEM/F-12+100 μg/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素),置于5% CO2、37 ℃培養箱中靜置培養5～6 h，待組織塊附著于瓶底，將培養瓶慢慢翻轉平放，使組織塊完全浸入培養液中，繼續置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養3～5 d，待有細胞從組織塊周圍擴展出后換液，以后每隔1～2 d換液。

1.2.3細胞鑒定 人臍靜脈內皮細胞和小鼠胸主動脈平滑肌細胞的形態學特征通過倒置相差顯微鏡鑒定，細胞的蛋白標志物通過免疫熒光鑒定。將細胞傳至12孔細胞培養板中，待細胞融合度達80%，棄培養上清液；用PBS清洗2次，免疫熒光固定液室溫固定30 min；用PBS清洗3次，每次5 min；加入免疫熒光封閉液，室溫封閉30 min；棄封閉液，用PBS清洗3次，每次5 min；分別加入內皮細胞特異性蛋白標志物(FactorⅧ、CD31、Pan-Cadherin)、平滑肌細胞特異性蛋白標志物(SM22-α和α-actin)一抗，4 ℃過夜孵育；用PBS清洗3次，每次5 min；加入二抗搖床避光孵育2 h；用PBS清洗3次，每次5 min；加入DAPI，室溫孵育10 min，用PBS清洗3次，每次5 min；用熒光顯微鏡對細胞進行成像。

1.2.4細胞培養和傳代 人臍靜脈內皮細胞采用含有10% FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM/F-12培養基于5% CO2、37 ℃培養箱中培養，每1～2 d換液。小鼠胸主動脈平滑肌細胞采用含有20% FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM/F-12培養基于5% CO2、37 ℃培養箱中培養，每2～3 d換液。兩種細胞的傳代均待細胞融合至85%后，用PBS清洗3次，加入含有0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，當細胞皺縮成圓形時，立即加入等體積完全培養基終止消化，收集細胞于離心管中，1 500 r/min離心3 min，棄上清液，加入完全培養基，按1 ∶2的比例接種于培養瓶中培養。

1.2.5人臍靜脈內皮細胞外泌體的提取與鑒定 Gibco小牛血清41 100 r/min 4 ℃離心10 h，取上層澄清液體即為無外泌體血清。用無外泌體血清配置的無外泌體完全培養基培養人臍靜脈內皮細胞，收集48 h細胞培養上清液60 ml，在4 ℃環境下，于高速離心機中分別以1 200 r/min離心10 min，3 100 r/min離心10 min以及16 600 r/min離心30 min連續離心的方法去除上清液中的懸浮細胞、死細胞、細胞碎片、microvesicle及凋亡小體等雜質；用0.22 μm濾膜過濾離心后上清液；41 100 r/min超速離心70 min后棄上清液；用1 ml PBS重懸底部沉淀即為外泌體懸液。外泌體鑒定利用Western blot檢測蛋白標志物Hsp70、CD9、CD63、TSG101。同時，利用電子顯微鏡對所提取的外泌體進行大小和完整性鑒定。

1.2.6高內涵示蹤平滑肌細胞攝取外泌體 外泌體的熒光標記利用PKH67試劑盒，實驗按照試劑盒操作說明進行。超速離心后得到的人臍靜脈內皮細胞外泌體棄上清液，用250 μl Diluent C重懸外泌體；同時，取1 μl PKH67稀釋于750 μl Diluent C中；將重懸后的外泌體和稀釋后的PKH67混勻室溫靜置10 min；加入1 ml 0.5%的BSA以結合過量的染料；41 100 r/min超速離心70 min后棄上清液，并重懸于平滑肌細胞完全培養基中，即得到PKH67標記的外泌體。將標記后的人臍靜脈內皮細胞外泌體與已貼壁生長的小鼠胸主動脈平滑肌細胞共同培養，利用共聚焦高內涵成像分析儀的40倍鏡和共聚焦模式對其進行成像，分析小鼠胸主動脈平滑肌細胞對人臍靜脈內皮細胞外泌體的攝取情況。

1.2.7ATG5-siRNA轉染 將處于對數期生長的第8代人臍靜脈內皮細胞均勻接種于6孔板，培養24 h后細胞密度達40%，實驗組同時加入ATG5-siRNA1(靶序列：5′-GATTCATGGAATTGAGCCA-3′)和ATG5-siRNA2(靶序列：5′-GAAGTTTGTCCTTCTGCTA-3′)共轉染，陰性對照組加入NC-siRNA轉染，轉染步驟參照廣州銳博生物科技有限公司siRNA產品使用說明。轉染48 h后分別收集細胞總蛋白，利用蛋白質印跡法檢測ATG5蛋白表達情況。

1.2.8高內涵檢測內皮細胞外泌體影響平滑肌細胞增殖 siRNA轉染第8代人臍靜脈內皮細胞48 h后換無外泌體完全培養基繼續培養48 h，分別收集實驗組和對照組外泌體。將處于對數期生長的第12代小鼠胸主動脈平滑肌細胞接種于24孔板中，過夜培養后換無外泌體完全培養基，并按0、100、200 μg/ml的濃度分別加入實驗組和對照組外泌體。利用高內涵明場成像和DPC模式實時動態監測平滑肌細胞增殖情況。

1.3 統計學處理所有結果以及圖形分別利用PowerPoint、ImageJ、Harmony4.8、GraphPad Prism 6軟件處理和統計分析。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人臍靜脈內皮細胞的形態學和免疫熒光鑒定原代分離的人臍靜脈內皮細胞在培養2 d后呈現明顯地貼壁生長。通過倒置相差顯微鏡觀察，單個細胞在形態上呈長梭形、多角形或橢圓形，是典型的鵝卵石樣形態(圖1A1)。原代細胞在培養7 d后融合度達85%(圖1A2)。血管內皮細胞表面標志物Pan-Cadherin和CD31，以及血管內皮細胞內標志物Factor Ⅷ的免疫熒光結果(圖1B)顯示，96%的細胞呈Cy3陽性。Pan-Cadherin和CD31陽性細胞的Cy3熒光主要分布在細胞膜和細胞間的連接處上，符合Pan-Cadherind和CD31的膜蛋白的定位。Factor Ⅷ陽性細胞的Cy3熒光主要集中在細胞質中，熒光染色范圍明顯小于CD31和Pan-Cadherin陽性細胞。

圖1 人臍靜脈內皮細胞的形態學鑒定和免疫熒光結果

2.2 小鼠胸主動脈平滑肌細胞的形態學和免疫熒光鑒定在倒置相差顯微鏡下，小鼠胸主動脈組織塊貼壁培養3 d可明顯觀察到有細胞(即為P0代平滑肌細胞)從組織塊邊緣游離出來；培養5 d，游離細胞融合度達75%；培養7 d，游離細胞融合度達90%。經過傳代培養，在倒置相差顯微鏡下觀察P1代平滑肌細胞，細胞大多呈長梭形，少數呈多角形(圖2A)。血管平滑肌細胞表型標志蛋白SM22-α和α-actin的免疫熒光結果顯示，95%的細胞呈Cy3陽性(圖2B)。

2.3 人臍靜脈內皮細胞外泌體的鑒定蛋白免疫印跡結果顯示，超速離心法提取的人臍靜脈內皮細胞外泌體含有外泌體標志蛋白Hsp70、TSG101、CD9和CD63(圖3A)。電子顯微鏡下觀察所提取的外泌體雙層膜結構完整，直徑為50～150 nm(圖3B)。

2.4 平滑肌細胞攝取內皮細胞外泌體的熒光示蹤在共聚焦高內涵成像分析系統(HCS)40倍共聚焦成像模式下，利用DAPI(藍色)染色追蹤小鼠胸主動脈平滑肌細胞，利用PKH67(綠色)染色追蹤外泌體。高內涵記錄共培養0、30、60、120、240 min時平滑肌細胞對外泌體的攝取情況。結果顯示小鼠胸主動脈平滑肌細胞在共培養30 min后開始攝取PKH67標記的人臍靜脈內皮細胞外泌體，共培養4 h后，平滑肌細胞攝取的外泌體明顯增多(圖4)。

圖3 外泌體的鑒定

2.5 人臍靜脈內皮細胞siRNA干擾組的ATG5蛋白合成明顯降低實驗組和對照組Western blot檢測結果(圖5)顯示在siRNA轉染細胞48 h后，實驗組ATG5蛋白表達明顯降低。

2.6 高內涵揭示ATG5介導內皮細胞外泌體調控平滑肌細胞增殖本研究利用高內涵DPC模式對隨機視野中的細胞數量進行96 h的不間斷統計得到平滑肌細胞的增殖曲線(圖6)，表明siRNA干擾人臍靜脈內皮細胞ATG5表達后分泌的外泌體在濃度達到200 μg/ml時能夠明顯抑制小鼠胸主動脈平滑肌細胞的增殖(圖6)。通過組間分析，與對照組比較，外泌體濃度為200 μg/ml時，平滑肌細胞的增殖曲線存在顯著差異(P<0.01)。

3 討論

眾所周知，除了毛細血管和毛細淋巴管外，血管壁主要由三層膜結構組成，內膜由內皮細胞構成，中膜(中動脈)主要由平滑肌細胞參與構成，外膜由疏松結締組織組成。血管平滑肌細胞在構成血管壁、維持血管張力上發揮著重要作用，而它的異常增殖和遷移在高血壓、動脈粥樣硬化等疾病的發生發展過程中發揮重要作用。內皮細胞是血液與組織之間的一道具有半透膜性質的屏障，能夠分泌多種活性因子，其內皮細胞損傷或功能障礙可引發系列心血管疾病。例如，內皮細胞損傷后釋放的細胞因子使血液中白細胞貼壁引發炎癥反應，誘導中層血管平滑肌細胞的增殖和遷移，并伴隨細胞外基質的分泌和沉積，造成粥樣硬化等。由此可見，內皮細胞與平滑肌細胞之間存在信息交流，相互影響，共同維持著內環境的穩定，但是其作用機制目前尚不明了。

圖4 HCS示蹤平滑肌細胞攝取PKH67標記的外泌體

圖5 SiRNA干擾HUVEC ATG5表達的Western blot鑒定

圖6 高內涵DPC模式監測VSMC增殖曲線

外泌體是包含了核酸、蛋白質等生物活性物質的小囊泡，廣泛存在于血液、尿液、腦脊液、乳汁等體液之中。外泌體可通過與受體細胞的細胞膜融合或與細胞膜上特異性受體結合釋放活性內容物，從而介導細胞間的信息傳遞，調控機體的生命活動，也與多種疾病的發生與進程密切相關。

在乳腺癌細胞的研究中發現，自噬相關蛋白ATG5通過調節乳腺癌細胞多囊泡體的pH來影響外泌體的形成，和參與微管相關蛋白的酶促級聯修飾并將催化產物轉移至外泌體，介導外泌體促進臨近乳腺癌細胞的遷移和侵襲。敲除ATG5基因的乳腺癌細胞產生外泌體的量顯著下降且外泌體內不含微管相關蛋白相關催化產物。在肺動脈血管內皮細胞的研究中發現，缺氧和炎癥可誘導肺動脈內皮細胞外泌體的釋放，并引起肺動脈平滑肌細胞的過度增殖和遷移。

血管平滑肌細胞的異常增殖、遷移及表型轉化是心血管病，如動脈粥樣硬化，發生與發展的關鍵始動因素之一。本研究以人臍靜脈內皮細胞和小鼠胸主動脈平滑肌細胞為材料，研究siRNA干擾ATG5蛋白合成的內皮細胞所產生的外泌體對平滑肌細胞增殖的影響，同時利用共聚焦高內涵成像分析系統示蹤平滑肌細胞攝取內皮細胞外泌體的過程，為探索調控平滑肌細胞異常增殖提供新的思路。

本研究結果顯示，小鼠主動脈平滑肌細胞在體外培養30 min后開始攝取內皮細胞外泌體；通過siRNA干擾ATG5蛋白合成的內皮細胞所產生的外泌體在200 μg/ml濃度時可以顯著抑制平滑肌細胞的增殖。但ATG5如何影響內皮細胞外泌體的產生，是否依賴于自噬，還是直接作用于外泌體形成的相關蛋白尚有待研究。另外，在siRNA干擾內皮細胞ATG5蛋白合成后，所產生的外泌體中組分是否發生質和量的改變，外泌體進入平滑肌細胞后是通過何種信號通路來調控增殖尚有待考察。

綜上所述，本研究揭示了ATG5能夠介導內皮細胞外泌體來調控平滑肌細胞增殖，為平滑肌細胞功能異常而導致的心血管疾病的防治提供了新的思路，但調控的具體機制有待進一步研究。