子宮內膜間質細胞來源外泌體miRNA表達譜的差異分析

王禮賢，胡月陽，李 琰，楊 漪，康 山

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是子宮內膜細胞生長到子宮內腔以外位置[1]，異位組織中子宮內膜間質細胞(endometrial stromal cells，ESC)圍繞、內膜腺體生長，ESC、內膜腺體類似腫瘤特征可向周圍器官轉移，導致多種并發癥產生[2]。EMs發病率在育齡期婦女中高達10%～15%，且有不斷上升的趨勢，嚴重影響女性生活質量和身心健康。微小RNA(microRNA，miRNA)是一段短鏈非編碼RNA，表達異常與腫瘤的發生發展息息相關，已經證明可參與子宮肌瘤[3]、卵巢癌[4]、宮腔黏連[5]等婦科疾病免疫逃逸及微環境形成等過程。為探究miRNA與EMs的關系，該研究對兩組外泌體miRNA表達譜進行檢測，分析其差異表達，為下一步miRNA靶基因預測信號通路富集分析做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 一般資料2017年1月～2018年12月河北醫科大學第四醫院確診為EMs患者為研究對象，40例，年齡24～37(30.58±4.18)歲，病灶分布特點：腹膜型9例，卵巢型21例，深部型10例；根據美國生殖醫學協會EMs分期標準，Ⅰ期6例，Ⅱ期12例，Ⅲ期14例，Ⅳ期8例；另選取同一時期腹腔鏡檢查子宮內膜正常子宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅲ子宮手術(其中23例宮頸病變表面破壞術、17例宮頸局部切除術，月經結束3～7 d手術)患者為對照組，40例，年齡24～38(30.51±3.69)歲，兩組患者年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。EMs診斷標準：腹腔鏡手術確診[6]。EMs患者納入標準：① 均已確診為EMs患者；② 月經規律的育齡期婦女；③ 年齡>20歲；④ 本研究患者知情同意，經醫院倫理委員會審查并通過。排除標準：① 子宮內膜病變接受激素治療患者；② 急性全身感染性疾病患者；③ 懷孕期及哺乳期婦女；④ 多種藥物過敏者；⑤因精神或其他疾病情況無法參加該項研究者。

1.2 試劑與器材磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(美國HyClone公司)；10%胎牛血清、DMEM(美國Gibco公司)；I型膠原酶(美國ATCC公司)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；3%雙氧水(江山市雙氧水有限公司)；醋酸雙氧鈾(青島捷世康生物科技有限公司)；波形蛋白單抗、角蛋白單抗(上海碧云天公司)；Total Exosome Isolation試劑盒、RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)； cDNA反轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)；2×Hi SYBR Green QPCR Mix(北京百奧萊博科技有限公司)。光學顯微鏡(日本Olympus公司)；Spectra S/TEM 掃描透射電子顯微鏡[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；Agilent 2200 TapeStation(中國安捷倫科技有限公司)；Illumina HiSeqTM 2500測序儀(南京迪康金諾生物技術有限公司)；qRT-PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 樣本采集鈍器刮取EMs患者異位內膜組織、CIN Ⅲ患者正常內膜組織，放入預冷的裝有無菌的廣口瓶中清洗3次，浸泡在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，立即送回實驗室處理。

1.4 ESC外泌體收集

1.4.1ESC原代培養與純度鑒定 ESC原代培養參考文獻[7]中方法并改進進行。眼科剪剪碎上述組織，加入無血清DMEM培養基反復吹打后移至離心管中，加400 μl 0.25% Ⅰ型膠原酶消化，組織呈絮狀即可終止消化，消化時間80～160 min，用400目過濾，過濾液放入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入含12%胎牛血清的DMEM培養液，置37 ℃ CO2培養箱培養，每天觀察細胞形態，常規換液培養細胞，細胞24 h開始貼壁，72 h細胞貼壁完成。4%多聚甲醛固定、3%雙氧水封閉細胞，分別加入波形蛋白單抗、角蛋白單抗孵育；同時設置陰性對照，二抗孵育后滴加辣根酶標記的鏈酶卵白素工作液封片，光學顯微鏡觀察。培養結果：研究組收集成功37例，對照組收集成功36例。鑒定成功細胞置于新的培養皿中培養，細胞培養5 d拍照。

1.4.2ESC外泌體的分離與鑒定 ESC外泌體分離與鑒定參考文獻[8]，Total Exosome Isolation試劑盒法提取ESC外泌體，具體步驟：收集ESC后2 000 r/min離心30 min，轉移上層清液至新離心管中，加1/2樣本量的試劑，混勻后4 ℃過夜，10 000 r/min離心1 h后棄上清，50 μl PBS重懸沉淀后至-80 ℃保存。醋酸雙氧鈾負染透射電鏡觀察外泌體形態并鑒定。

1.5 ESC外泌體miRNA表達譜芯片檢測從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期EMs患者外泌體中隨機選出3期，再每期中隨機選1例為代表；對照組則采用隨機數字法抽3例進行芯片表達譜實驗。Agilent 2200 TapeStation進行RNA建庫，Illumina HiSeqTM 2500測序儀對質檢文庫運進行測序，分析兩組外泌體miRNA差異性。

1.6 qRT-PCR檢測ESC外泌體miR-205、miR-542-3p水平取-80 ℃冰箱兩組ESC外泌體，RNA提取試劑盒提取總RNA，cDNA反轉錄試劑盒反轉錄cDNA，qRT-PCR儀對miR-205、miR-542-3p、U6擴增。miR-205-F：5′-CACGTCCCAGGCTCCA-3′,miR-205-R：5′-CGGGCATCGAAACTGCCAAT-3′；miR- 542-3p-F：5′-TGTGACAGATTGATAACT-3′，miR-542-3p-R：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC GCACTGGATACGACCTGCGGTTTCAGT-3′；U6-F：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，U6-R：5′-GG AACGCTTCACGAATTTG-3′。上樣體系：cDNA 1 μl(50 ng/μl)，F/R(10 μmol/L)各0.5 μl，2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μl，ddH2O 8.0 μl。反應條件：95 ℃、90 s；95 ℃、30 s；60 ℃、55 s；45個循環。2-ΔΔCt法對miR-205、miR-542-3p表達水平定量分析。

2 結果

2.1 兩組ESC比較研究組細胞平鋪貼壁生長，細胞呈長梭形，邊緣清晰，形狀規則。對照組細胞雖平鋪貼壁生長，部分細胞呈長梭形，亦有細胞呈三角形或多角形，邊緣輪廓不清晰，形狀相對研究組不規則。見圖1。

圖1 兩組ESC培養過程中代表性相襯圖像 ×100A：研究組；B：對照組

2.2 兩組細胞外泌體鑒定ESC外泌體直徑在30～150 nm之間，球形，囊泡狀結構。兩組ESC外泌體結構類似。見圖2。

圖2 醋酸雙氧鈾負染后ESC外泌體透射電鏡下形態 ×200

2.3 兩組ESC外泌體差異miRNA篩選研究組與對照組ESC外泌體有39種miRNA的表達差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，研究組上調miRNA 14個，下調25個，部分差異表達的miRNA見表1。雙聚類分析圖顯示關系相近的miRNA聚在一起。見圖3。

表1 研究組差異表達的miRNA

圖3 兩組ESC外泌體中差異miRNA雙聚類分析

2.4 兩組ESC外泌體中qRT-PCR檢測miR-205、miR-542-3p表達量與對照組比較，研究組ESC外泌體miR-205表達量升高，miR-542-3p表達量降低(P<0.05)。見表2。

表2 兩組ESC外泌體qRT-PCR檢測miR-205、miR-542-3p水平

2.5 miRNA芯片檢測與qRT-PCR檢測ESC外泌體差異倍數比較miRNA芯片檢測與qRT-PCR檢測ESC外泌體差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.6 靶基因預測microTv3.0、Targestscan、PicTar 3種靶基因預測網站預測ESC外泌體上調倍數最高的7個、下調倍數最高的8個miRNA與EMs有關預測的靶基因，2種或2種以上預測網站中出現靶基因。見表4。

表3 miRNA芯片檢測與qRT-PCR檢測ESC外泌體比較

表4 EMs中差異靶位點預測

3 討論

EMs屬良性疾病，但有侵襲、種植、轉移等惡性生物學行為，被稱為“良性癌癥”。臨床并發癥主要表現為痛經、慢性盆腔痛、月經紊亂和不孕等[9]。需長期使用藥物治療，副作用大、效果不理想，且術后復發率高[10]，嚴重影響患者身心健康。因此尋找早期生物學標志物可提早預防疾病。外泌體是由細胞向細胞外間隙處釋放的脂質雙分子層小囊泡，內含多種RNA，其中成熟的miRNA含量最高，約占41.72%[11]。腫瘤細胞源外泌體miRNA參與腫瘤發生、轉移、免疫逃逸以及微環境的形成等過程，與腫瘤的發生發展息息相關。

以往研究[12]中已發現外泌體miRNA影響疾病發生進程。外泌體miR-210是腎癌的標志物，在腎癌組織中高表達，影響腎癌疾病進程；外泌體miRNA在胃癌中可影響胃癌的生長、復發、腫瘤耐受等，且穩定性較好[13]。有臨床研究[14-15]顯示，EMs患者外泌體中miR-21較非EMs患者明顯增加，對血管生成具有重要作用，與EMs發生發展存在一定聯系。亦有研究[16]報道，miR-183在細胞增殖、凋亡中發揮重要作用，其表達下調可抑制凋亡，增強侵襲能力。本研究以EMs患者異位內膜ESC外泌體為研究對象、CIN Ⅲ患者正常內膜組織ESC外泌體為對照組，體外離體培養兩組ESC發現外觀相似，細胞均貼壁生長、呈長梭形，少部分呈星形，提示ESC分離成功，電鏡下觀察兩組ESC外泌體直徑均在30～150 nm之間，球形，囊泡狀結構，且純度較高。miRNA芯片檢測人類847種miRNA發現在兩組ESC外泌體中39種miRNA表達有差異；與對照組比較，研究組上調14個，下調25個，與梁靜 等[17]子宮內膜樣腺癌組織中microRNA差異表達譜部分miRNA相同，卻不完全一致。本研究中研究組miR-205相對表達量升高最多，miR-542-3p相對表達量降低最多，qRT-PCR驗證ESC外泌體miR-205、miR-542-3p表達倍數與芯片檢測結果類似，提示miR-205、miR-542-3p與EMs關系密切，提示外泌體可作為非侵入性診斷EMs有效生物標志物，其功能與特性為臨床靶向治療提供新方向。

miR-205表達升高在食管癌中可加快細胞侵潤遷移、在乳腺癌中可促進淋巴結轉移和腫瘤生長[18]。miR-542-3p在腫瘤細胞轉移過程中發揮抑癌作用，表達量降低可加速結腸癌、星型細胞瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[19]。靶基因預測發現miR-205、miR-200a、miR-200b、miR-542-3p、miR-9都可調控PTEN基因，PTEN是第一個迄今為止發現有雙特異性磷酸活性的腫瘤抑制基因，在EMs中可判斷預后[20]；提示這些miRNA可能通過調控PTEN進而影響腫瘤發生。miR-205、miR-200a、miR-200b都位于1號染色體且表達上調，提示EMs患者可能在1號染色體上發生基因重組，影響EMs表達差異。miR-542-3p、miR-9在EMs中表達下調，與陳觀盛等[21]的研究結果一致，提示可能以原癌基因為靶點，表達下降可促進原癌基因表達，影響EMs發生發展進程，但關于EMs病因有待進一步探究，故外泌體在EMs中的作用機制仍待闡明。

本研究借助芯片數據，挖掘與EMs有重要影響的ESC外泌體miRNA，并對其差異miRNA分析，初步驗證ESC外泌體中上調倍數最多的7個、下調倍數最多的8個與EMs有關的靶基因，對EMs患者ESC外泌體中miRNA表達水平有了進一步了解，為分子靶向治療、探討相關疾病提供分子理論基礎。