白藜蘆醇對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的保護作用研究

陳妮娜，牛 迪

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是圍生期窒息引起的新生兒缺血缺氧性腦損傷(HIBD)，可遺留永久性神經(jīng)功能缺損，造成認知和運動功能障礙、腦癱、癲癇等后遺癥，不僅直接影響患兒的身心健康，同時給家庭、社會均造成極大負擔[1]。在HIE的病理生理過程中，缺血缺氧刺激炎癥反應、氧化應激反應、細胞凋亡過度激活與神經(jīng)功能損害的發(fā)生密切相關，針對性地進行抗炎、抗氧化、抗凋亡是治療HIE的常見思路[2-4]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從虎杖、葡萄等植物、水果中提取的多酚類化合物，具有抗炎、抗凋亡的藥理學作用，在缺血再灌注引起腦損傷、心肌損傷的過程中均起到保護作用[5-6]，但用于HIE治療的效果尚不明確。基于此，本實驗以HIBD的新生大鼠作為研究對象，具體分析Res對腦損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 取7 d齡新生SD雄性大鼠36只，體質(zhì)量10～15 g，購自北京維通利華動物實驗公司，生產(chǎn)合格證號：SCXK(京)2018-0001；Res購自Sigma公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自上海西唐公司，RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天公司，Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3、SIRT1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的單克隆一抗購自Abcam公司。

1.2 分組、造模及干預方法 將36只7 d齡新生SD大鼠分為假手術組(Sham組)、HIBD組、Res組，每組12只。HIBD組和Res組按照下列方法造模：腹腔注射水合氯醛麻醉后取仰臥位，做頸正中切口、分離右側(cè)頸總動脈并結(jié)扎；縫合切口后恢復2～3 h，將新生大鼠放入缺氧箱中，通氣條件為8%O2及92%N2、1 L/min、37 ℃，持續(xù)2 h。完成造模后，Res組給予Res 60 mg/kg(體積50 μL)腹腔注射，Sham組、HIBD組給予50 μL生理鹽水腹腔注射，然后放回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.3 神經(jīng)功能評價 造模后48 h，每組大鼠隨機選取6只大鼠，參照Longa評分法對神經(jīng)功能進行評價，共0～4分，得分越高提示神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.4 腦組織含水量檢測 將完成神經(jīng)功能評價的6只大鼠處死，用干濕重法檢測腦組織含水量，解剖缺血缺氧一側(cè)腦組織，稱濕重，而后放入100 ℃烘箱烘干24 h，稱干重，計算腦組織含水量，腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重。

1.5 腦組織中炎癥細胞因子的檢測 造模后48 h，每組剩余的6只大鼠直接處死，解剖缺血缺氧一側(cè)的腦組織后，采用RIPA裂解液裂解組織，提取蛋白，采用BCA試劑盒測定總蛋白含量，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、ICAM-1的含量，計算每毫克總蛋白中TNF-α、IL-1β、ICAM-1的含量。

1.6 腦組織中蛋白表達的檢測 取缺血缺氧一側(cè)腦組織裂解后得到的蛋白，經(jīng)BCA試劑盒定量后取30 μg蛋白進行蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)檢測，將蛋白樣本加入SDS-PAGE后進行電泳、電轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉NC膜2 h，4 ℃孵育Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、SIRT1、NF-κB及β-actin的一抗過夜；次日，室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗1 h，加入ECL顯影液、曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值并以β-actin為內(nèi)參計算蛋白表達量。

2 結(jié) 果

2.1 3組神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量比較 造模后48 h，與Sham組比較，HIBD組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量均明顯增加(P<0.05)；與HIBD組比較，Res組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量均明顯下降(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量比較(±s)

2.2 3組腦組織中炎癥細胞因子含量比較 造模后48 h，與Sham組比較，HIBD組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量均明顯增加(P<0.05)；與HIBD組比較，Res組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量均明顯下降(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組腦組織中炎癥細胞因子含量比較(±s) 單位：ng/mg pro

2.3 3組腦組織中凋亡基因表達比較 造模后48 h，與Sham組比較，HIBD組大鼠腦組織中Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達量均明顯增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量明顯減少(P<0.05)；與HIBD組比較，Res組大鼠腦組織中Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達量均明顯減少(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達量明顯增加(P<0.05)。詳見表3及圖1。

表3 3組腦組織中凋亡基因表達比較(±s)

圖1 3組腦組織中凋亡基因的蛋白條帶圖

2.4 3組腦組織中SIRT1/NF-κB表達比較 造模后48 h，與Sham組比較，HIBD組大鼠腦組織中SIRT1蛋白表達量明顯減少(P<0.05)，NF-κB蛋白表達量明顯增加(P<0.05)；與HIBD組比較，Res組大鼠腦組織中SIRT1蛋白表達量明顯增加(P<0.05)，NF-κB蛋白表達量明顯減少(P<0.05)。詳見表4及圖2。

表3 3組腦組織中SIRT1、NF-κB表達比較(±s)

圖2 3組腦組織中SIRT1/NF-κB的蛋白條帶圖

3 討 論

HIE的發(fā)生與缺血缺氧刺激下炎癥反應、氧化應激反應、細胞凋亡的過度激活密切相關，多種具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用的藥物在HIE的治療中展現(xiàn)出積極作用。Res是具有抗炎、抗凋亡、抗氧化作用的植物多酚，其廣泛的藥理學作用在近些年受到了越來越多的關注。在缺血再灌注引起心肌組織損傷及腦組織損傷的過程中、七氟烷暴露引起新生大鼠神經(jīng)功能損害的過程中，Res均能起到保護作用[5-7]。本實驗以7 d齡的新生大鼠為研究對象，在建立HIBD模型后用Res進行干預，通過神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量變化反映腦損傷的程度，結(jié)果顯示，Res組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量均明顯低于HIBD組，說明Res干預能夠減輕新生大鼠HIBD，在腦損傷的過程中能夠起到保護作用。Res的抗炎及抗凋亡活性已經(jīng)在腦組織缺血再灌注損傷模型、七氟烷暴露致新生大鼠認知功能障礙模型中得到證實[8-9]。在缺血缺氧引起新生大鼠發(fā)生腦損傷的過程中，同樣涉及炎癥反應的過度激活。已有研究報道，在HIBD過程中，TNF-α、IL-1β、ICAM-1等具有促炎及黏附活性的細胞因子大量釋放，介導了炎癥細胞向腦組織的黏附、浸潤及炎癥反應的級聯(lián)放大[10-11]。本實驗結(jié)果與其吻合，HIBD組腦組織中TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量明顯增加，在造模后用Res干預，Res組腦組織中TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量明顯低于HIBD組，說明Res能夠減少多種炎癥細胞因子的釋放，進而在HIBD的過程中起到抗炎作用并減輕炎癥反應激活對神經(jīng)功能的損害。

細胞凋亡的過度激活是HIBD過程中除炎癥反應外的另一重要病理環(huán)節(jié)，線粒體凋亡途徑是在缺血缺氧條件下介導細胞凋亡的主要機制[12]。Bax和Bcl-2是線粒體外膜上一對調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的分子，前者在線粒體外膜上形成同源二聚體，成為線粒體內(nèi)細胞色素C進入胞漿的通道，高表達的Bax能夠增加細胞色素C進入胞漿并通過一系列級聯(lián)反應來使Caspase-3的前體裂解為有活性的Cleaved-Caspase-3并介導細胞凋亡[13]；后者在線粒體外膜上與Bax形成異源二聚體，阻礙Bax對細胞凋亡的促進作用，抑制Cleaved-Caspase-3的生成及細胞凋亡[14]。本實驗結(jié)果顯示，HIBD組腦組織中Bcl-2的表達明顯減少，而Bax、Cleaved-Caspase-3的表達明顯增多，說明缺血缺氧刺激了腦組織中線粒體途徑凋亡的激活。在Res干預后，腦組織中Bcl-2的表達明顯增加，而Bax、Cleaved-Caspase-3的表達明顯減少，說明Res能夠抑制缺血缺氧腦損傷過程中線粒體途徑凋亡的激活。

SIRT1是神經(jīng)元內(nèi)感受能量代謝的分子，通過介導去乙酰化反應作用于下游NF-κB，抑制NF-κB的活性及表達并使受到NF-κB調(diào)控的炎癥反應、細胞凋亡均受抑制[15]。當局部組織發(fā)生缺血缺氧時，能量代謝存在異常并使SIRT1的表達發(fā)生下調(diào)，進而使其抑制NF-κB的作用減弱并造成NF-κB介導的促炎、促凋亡效應增強[16-17]。本實驗對SIRT1/NF-κB通路的分析顯示，HIBD組大鼠腦組織中SIRT1的蛋白表達量均明顯減少，NF-κB蛋白表達量明顯增加，說明在HIBD過程中SIRT1受到抑制、下游NF-κB激活；應用Res干預后，腦組織中SIRT1的蛋白表達量明顯增加，NF-κB的蛋白表達量明顯減少，說明Res能夠在HIBD的過程中調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB通路，這也可能是Res發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用的分子機制。

綜上所述，Res能夠減輕新生大鼠HIBD，減輕腦組織中的炎癥反應及線粒體途徑細胞凋亡，調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB通路可能是Res發(fā)揮上述調(diào)節(jié)作用的分子機制。