水溶性酞菁鋅納米粒的合成及光動力活性研究

李林森，徐暉，劉瑞明，汪亞倫?

（1.沈陽醫學院基礎醫學院生物化學教研室，遼寧沈陽 110034；2.沈陽藥科大學藥學院藥劑教研室；3.沈陽醫學院基礎醫學院臨床醫學專業2016 級）

光動力學療法（photodynamic therapy，PDT）作為一種治療腫瘤的新方法，越來越受到醫療工作者和學者們的關注［1－2］。PDT 的基本原理是在腫瘤病變組織攝取一定量光敏劑后，利用特定波長的光照射腫瘤部位，光敏劑會將腫瘤組織的分子氧（O2） 轉化為具有細胞毒性的單線態氧（O1）或自由基，進而破壞腫瘤細胞來達到治療腫瘤的目的［3］。光敏劑作為氧分子形態轉換的關鍵因子，一直是PDT 研究的重點，而酞菁作為第二代光敏劑，具有穩定的化學性質、適宜的治療波長（650～700 nm） 以及體內滯留時間短等優點［4－5］。但是酞菁分子疏水性強的特點，也限制了其在臨床的進一步應用［6］。因此，本研究利用自組裝納米載藥系統提高酞菁鋅（ZnPc） 光敏劑的水溶性，通過四甲基偶氮唑藍（MTT） 法考察其對肝癌細胞HepG2 的光動力學作用，為PDT 抗腫瘤的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器 Synergy 4TM混合式多功能讀板機（美國BioTek 公司），激光粒度測定儀（英國Malvern Panalytical 公司），LED 光能祛痘燈（青島陽光動力生物醫藥技術有限公司），BSA124S 電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 材料 酞菁鋅（ZnPc） （中國藥品生物制品檢驗所，CAS：14320－04－8），聚乳酸－聚羥基乙酸（poly （lactic－co－glycolic acid，PLGA，Mw：7 000－17 000）、聚乙二醇 （polyethylene glycol，PEG，Mw：2 000）、透析袋MD25 （8 000－14 000 D）、脫氧膽酸鈉（SDC，Mw：414.56） （北京索萊寶科技有限公司），N－甲基吡咯烷酮（NMP）、1－ （3－二甲氨基丙基）－ 3－ 乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N－羥基琥珀酰亞胺（NHS） （美國Amresco 公司），MTT 細胞增殖與毒性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），細胞培養瓶、96 孔板（美國Corning 公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），RPMI－1640 培養基（美國Gibco BRL 公司），胰蛋白酶（美國Invitrogen 公司），人肝癌細胞HepG2 細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞庫）。

1.3 方法

1.3.1 溶劑擴散法制備ZnPc－PLGA－PEG （zinc phthalocyanine－poly （lactic－co－glycolic acid）－polyethylene glycol） 納米粒和PLGA－ PEG （poly（lactic－co－glycolic acid）－polyethylene glycol） 空白納米粒并行粒徑測量 稱取100 mg PLGA、0.96 mg NHS、1.59 mg EDC 溶于2 ml NMP 中，冰水浴攪拌2 h；再稱取16.67 mg PEG 溶解于1 ml NMP中，完全溶解后，緩慢加入到上述PLGA 溶液中反應24 h，透析后離心濃縮至3 ml。

將上述反應液平均分成2 份，取一份緩慢滴加到純化水中至15 ml，得到PLGA－PEG 空白納米粒；精確稱量10.0 mg ZnPc 溶解于含有45 mg SDC 的1.5 ml NMP 中，與PLGA－PEG 溶液混合后，緩慢滴加到純化水中至30 ml，得到ZnPc－PLGA－PEG納米粒。標準曲線法測定ZnPc 藥物濃度。

ZnPc－PLGA－PEG 納米粒和PLGA－PEG 空白納米粒在室溫下靜置15 min 后，使用激光粒度儀的Malvern 系統 （Malvern ZEN，英國 Malvern Panalytical公司） 通過動態光散射測定兩者平均粒徑，測量多分散指數（PDI） 以評估ZnPc－PLGAPEG 納米粒粒度分布，結果取3 次測量值的平均值。

1.3.2 細胞培養 在含有100 單位／ml 的雙抗（青霉素與鏈霉素） 和體積分數10%的胎牛血清的RPMI－1640 培養基中進行HepG2 細胞培養，當細胞長滿培養瓶底部80%～90%時，用質量分數為0.25%的胰蛋白酶消化并傳代培養。當細胞生長到對數生長期時進行細胞毒性PDT 檢測實驗。

1.3.3 MTT 法測定ZnPc－PLGA－PEG 納米粒和PLGA－PEG 空白納米粒對HepG2 細胞的活力作用將處于對數生長期的HepG2 細胞用0.25%胰蛋白酶（含有EDTA） 消化，培養基終止消化后離心收集細胞，用含有10%胎牛血清的RPMI－1640 培養基重新懸浮細胞至密度為1.5×105個／ml 后，以每孔100 μl 細胞液迅速接種在96 孔培養板中，置于37 ℃培養箱中孵育16 h。更換新鮮培養基后加藥。設1 個對照組（只加培養液）、5 個實驗組（ZnPc－PLGA－PEG 納米粒終濃度分別為0.01、0.1、1、10 和100 μmol／L） 及等比例稀釋的5 個PLGA－PEG 空白納米粒組，每組為4 個復孔，置于37 ℃培養箱中孵育2 h；待細胞達到對數生長期后，更換培養基，用波長670 nm 的LED 燈光照5 min （光劑量約7.5 J／cm2） 后避光置于培養箱中；暗毒性實驗除未光照外，其他處理方式相同。16 h 后，利用MTT 法檢測細胞存活率并繪圖。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 5 軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZnPc－PLGA－PEG 納米粒和PLGA－PEG 空白納米粒的制備及粒徑考察 通過溶劑擴散法制備的PLGA－PEG 空白納米粒和ZnPc－PLGA－PEG 納米粒均以單體形式存在，穩定且不易聚集。PLGA－PEG 空白納米粒呈乳白色，并帶有淺藍色乳光，ZnPc－PLGA－PEG 納米粒呈深藍色。經檢測，PLGA－PEG 空白納米粒和ZnPc－PLGA－PEG 納米粒的粒徑分別為 （99.0 ± 50.3） nm 和 （101.0 ±47.1） nm，見圖1，PDI 分別為0.258 和0.217。ZnPc 的裝載增加了ZnPc－PLGA－PEG 納米粒的粒徑。

2.2 ZnPc－PLGA－PEG 納米粒和PLGA－PEG 空白納米粒的光毒性及暗毒性實驗 隨著ZnPc－PLGA－PEG 納米粒濃度的增加，在光照條件下，腫瘤細胞的存活率不斷下降，在10 μmol／L 的濃度下，腫瘤細胞的存活率只有4.6%，見圖2A；而同樣條件下的非光照組，腫瘤細胞的存活率一直保持在95%以上，見圖2B。在對未裝載ZnPc 的PLGAPEG 空白納米粒進行光毒性和暗毒性的實驗中發現，腫瘤細胞的存活率未發生明顯變化，這與ZnPc－PLGA－PEG 納米粒的暗毒性結果相近，均不影響細胞的正常生長。見圖3。

圖2 ZnPc－PLGA－PEG 納米粒的光毒性（A） 及暗毒性（B）

圖3 PLGA－PEG 空白納米粒的光毒性（A） 及暗毒性（B）

3 討論

在PDT 研究中，阻礙酞菁類光敏劑臨床應用最主要的因素即為其水溶性較差。一些研究中利用表面活性劑，如蓖麻油、吐溫等的加入，可以提高酞菁光敏劑的溶解性，但是也會帶來副作用［7］。因此，本實驗通過納米載藥系統改善酞菁鋅（ZnPc） 的水溶性及穩定性，取得了很好的效果。得到的ZnPc－PLGA－PEG 納米粒在水溶液中能夠長時間均勻存在，不易聚集，可以作為一種新型光敏劑開展進一步體內PDT 研究。

在PDT 研究中，光敏劑在光照（光毒性） 和非光照（暗毒性） 條件下對細胞的殺傷作用是考察其性質的重要指標之一，也是其臨床進一步應用可能性的重要參考。利用MTT 檢測方法證明，在光照條件下，ZnPc－PLGA－PEG 納米粒對HepG2細胞具有明顯的殺傷和抑制作用，在濃度10 μmol／L 的ZnPc 納米粒PDT 作用下，腫瘤細胞存活率小于5%；而非光照條件下，在各個濃度下，腫瘤細胞的存活率均大于95%，說明對腫瘤細胞產生的殺傷不是光敏劑的直接作用，而是光敏劑、光和氧氣等諸多因素共同作用的結果。在非光照條件下，光敏劑對細胞不會產生毒性作用，這在臨床應用中具有很大的益處，我們可以利用光源照射部位的選擇，提高PDT 治療的靶向性。

通過納米粒子裝載ZnPc 的方式可以提高光敏劑的光動力活性，但是納米粒子組成材料自身對細胞存活率的影響也需要進一步考察。高分子材料的選擇對于納米粒子的組裝起著至關重要的作用，其中材料的安全性是重中之重。在本實驗中以PLGA－PEG 空白納米粒作為對照，同樣進行了腫瘤細胞光毒性和暗毒性的考察。結果顯示，在光照和非光照條件下，PLGA－PEG 空白納米粒對腫瘤細胞的生長均無影響，說明ZnPc－PLGA－PEG納米粒對腫瘤細胞的殺傷作用全部來自于ZnPc 的PDT 作用，PLGA－PEG 空白納米粒的組裝材料是安全的。

綜上所述，ZnPc－PLGA－PEG 納米粒是一種安全、可靠的新型光敏劑，具有水溶性好、性質穩定等特點，對于人肝癌細胞HepG2 具有很好的殺傷和抑制作用，具有良好的臨床應用價值。