丹參酮ⅡA通過激活SDF-1/CXCR4軸對大鼠急性心肌梗死的保護作用

唐志愛，郭世燕，黃建波

0 引言

急性心肌梗死是指冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死。近年來，有研究發現，基質細胞生因子-1(Stromal cell-derived factor-l，SDF-l)/CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)軸的變化在心肌梗死的疾病進展和預后中起著重要作用[1-4]。SDF-1/CXCR4軸廣泛表達于機體的多種組織細胞中，且與血管生成、成骨分化、胚胎發育、神經修復等多種生理功能密切相關[5-8]。丹參酮ⅡA是從傳統中藥材丹參的干燥根及根莖中提取得到的一種單體化合物。研究表明，丹參酮ⅡA具有心臟保護作用及血管修復作用[9-12]，而丹參酮ⅡA通過調節SDF-1/CXCR4軸對急性心肌梗死大鼠的保護作用目前尚不明確。本文通過研究丹參酮ⅡA對急性心肌梗死大鼠的保護作用及對SDF-1/CXCR4軸的影響，為急性心肌梗死的臨床治療提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，SPF(Specific Pathogen Free)級別，6周齡，體重(180±20)g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，動物房溫度(22±2)℃，濕度(50%±10%)，適應性喂養1周后進行實驗。酶標儀購自北京島津公司，雙垂直電泳儀、轉印電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫學產品有限公司，全自動生化分析儀購自北京島津公司。丹參酮ⅡA購自西寶生物科技(上海)股份有限公司，SDF-1、CXCR4和GAPDH抗體均購自Proteintech公司，RNA提取試劑盒、cDNA逆轉錄試劑盒、RIPA蛋白裂解液、TNF-α、IL-6及IL-1β檢測ELISA試劑盒購自上海碧云天公司，ECL顯色液購自Thermo公司。

1.2 急性心肌梗死大鼠模型的建立及給藥 30只雄性SD大鼠隨機分為5組，每組6只，分別為對照組、模型組、丹參酮ⅡA低劑量組、丹參酮ⅡA中劑量組、丹參酮ⅡA高劑量組。模型組及丹參酮ⅡA低、中、高劑量組參照文獻方法建立急性心肌梗死大鼠模型[13-14]。大鼠以10%水合氯醛腹腔注射(0.3～0.35 ml/100 g)麻醉，麻醉滿意后置于手術臺，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標準Ⅱ導聯心電圖后，經口氣管插管同時用小動物呼吸機輔助呼吸，沿肋間隙方向于胸骨左旁第3～4肋間切開皮膚，逐層分離皮下組織、肌肉，于2～3肋間撐開進胸，向右上方推開胸腺，暴露心臟及大血管根部，切開心包，輕擠大鼠胸廓，將心臟擠出，用可吸收縫合線結扎冠狀動脈血管縫針，進針深度控制在0.1 cm，寬度為0.1～0.2 cm。以心電圖出現病理性Q波判斷為急性心肌梗死，若無病理性Q波，則再次結扎，以提高大鼠心肌梗死模型成功率，然后逐層縫合心腔。對照組僅開胸，不結扎冠狀動脈。所有大鼠腹腔注射青霉素，8萬U/只，連續3 d預防感染。造模完成后，丹參酮ⅡA低、中、高劑量組根據大鼠體重，按20 ml/kg分別灌胃給予大鼠1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml的丹參酮ⅡA[15-16]，對照組及模型組20 ml/kg灌胃給予生理鹽水，每日定時給藥1次，連續給藥21 d，最后一次給藥24 h后進行后續實驗。

1.3 大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平測定 所有大鼠最后一次給藥24 h后，通過眼眶后靜脈叢取血至肝素潤洗過的離心管中，4 ℃靜置4 h，然后置于離心機中，4 ℃、3 500 r/min離心10 min。取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血漿中TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.4 血流動力學檢測 按照0.3～0.35 ml/100 g對大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉后，將壓力容積導管經左頸動脈插入大鼠的左心室(Left ventricle，LV)腔內，接入壓力換能器，應用生物機能實驗系統，記錄LV舒張末期容積(End-diastolic volume，EDV)、收縮末期容積(End-systolic volume，ESV)，并按照以下公式計算大鼠左心室射血分數(Left Ventricle Ejection Fractions，LVEF)。

1.5 大鼠心肌組織樣本采集及組織蛋白的提取 斷頭處死后迅速分離大鼠心臟，用4 ℃預冷的生理鹽水沖洗干凈表面血液，用濾紙吸干表面水分后，然后將一部分心肌組織放入10%中性甲醛中固定，一部分用于實時定量PCR檢測，其余部分放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，置于4 ℃離心機以12 000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃儲存備用。

1.6 實時定量PCR檢測 采用RNA提取試劑盒分別提取各組大鼠心肌組織的總RNA。將提取的總RNA逆轉錄成cDNA后，熒光定量PCR檢測各組大鼠心肌組織中β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA的表達。各檢測基因的實時定量PCR引物見表1，實時定量PCR結果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

表1 實時定量PCR檢測的基因引物序列

1.7 蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色) 將在10%中性甲醛中固定24 h后的心肌組織轉移至75%酒精中，經自動組織脫水機脫水、透明處理，在石蠟包埋機中浸蠟、包埋，進行5 μm切片，水浴展開，撈片，瀝干，放恒溫箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常規HE染色，在顯微鏡下進行組織病理學觀察。HE染色步驟：①脫蠟:將石蠟切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min；②復水：依次置于100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min，各2次,然后把水吸干；③蘇木精染色：置于蘇木精溶液中2 min，自來水流水沖洗2 min，把水吸干；④分化：1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，吸干水；⑤伊紅染色:置于伊紅溶液中2 min；⑥脫水:依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(Ⅰ)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min；⑦封片：置于通風櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹膠封片。

1.8 Western blot 將凍存的心肌組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉膜，將分離的蛋白電轉移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經SDF-1、CXCR4及GAPDH抗體(1∶1 000)孵育后，4 ℃過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進行灰度值檢測。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA對急性心肌梗死大鼠體內炎癥因子水平的影響 大鼠體內TNF-α、IL-6及IL-1β水平見表2。結果表明，與對照組相比，模型組心肌梗死大鼠體內TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著升高(P<0.05)，提示心肌梗死的發病機制與大鼠體內炎癥因子水平的變化密切相關；與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組心肌梗死大鼠體內TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)，且隨著丹參酮ⅡA劑量的增加，大鼠體內TNF-α、IL-6及IL-1β水平逐漸降低，提示丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴性地顯著降低急性心肌梗死大鼠體內炎癥因子水平，改善急性心肌梗死大鼠體內炎癥狀態，緩解心肌梗死大鼠疾病進展。

表2 各組大鼠體內TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較(n=6)

2.2 丹參酮ⅡA對急性心肌梗死大鼠血流動力學的影響 各組大鼠血流動力學檢測結果見表3。結果表明，與對照組相比，模型組大鼠LVEDV、LVESV均顯著升高(P<0.05)，LVEF顯著降低(P<0.05)，提示造模成功；與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組心肌梗死大鼠LVEDV、LVESV均顯著降低(P<0.05)，LVEF顯著升高(P<0.05)，且表現出劑量依賴性，提示丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴性地改善急性心肌梗死大鼠血流動力學變化，降低心臟前后負荷，改善心肌梗死大鼠左心室射血分數，緩解大鼠疾病進展，改善心肌梗死大鼠疾病轉歸。

表3 各組大鼠血流動力學檢測結果比較(n=6)

2.3 丹參酮ⅡA對急性心肌梗死大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平的影響 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平見表4。結果表明，與對照組相比，模型組心肌梗死大鼠心肌組織Bax、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平均顯著升高(P<0.05)，Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)，提示大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平變化與急性心肌梗死發病機制密切相關；與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組心肌梗死大鼠心肌組織Bax、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平均顯著降低(P<0.05)，Bcl-2水平顯著升高(P<0.05)，且表現出劑量依賴性，提示丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴性地抑制急性心肌梗死大鼠心肌組織凋亡相關基因的表達，促進抗凋亡基因的表達，抑制急性心肌梗死大鼠心肌細胞的進一步壞死，改善大鼠疾病進展及轉歸。

表4 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平比較(n=6)

2.4 組織病理學檢查 各組大鼠心肌組織病理學檢查見圖1。結果表明，與對照組相比，模型組急性心肌梗死大鼠心肌組織細胞廣泛性壞死，可見炎性浸潤，提示造模成功；與模型組相比，丹參酮ⅡA低、中劑量組大鼠心肌組織炎性浸潤明顯減輕，心肌壞死細胞脫落減少，丹參酮ⅡA高劑量組大鼠心肌組織偶見炎性細胞浸潤及壞死細胞脫落，肌纖維清晰，提示丹參酮ⅡA能夠顯著改善急性心肌梗死大鼠心肌組織病理學改變，降低心肌組織炎癥水平，修復受損心肌肌纖維，恢復大鼠心肌組織細胞功能，緩解心肌梗死大鼠疾病進展，改善疾病預后。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學檢查(40×)注：A.對照組,B.模型組,C.丹參酮ⅡA低劑量組,D.丹參酮ⅡA中劑量組,E.丹參酮ⅡA高劑量組

2.5 丹參酮ⅡA對急性心肌梗死大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平的影響 各組大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平見圖2。結果表明，與對照組相比，模型組急性心肌梗死大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平顯著降低(P<0.05)，提示急性心肌梗死能夠抑制大鼠心肌組織SDF-1/CXCR4軸相關蛋白的表達；與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平顯著升高(P<0.05)，并表現出一定的劑量依賴性，提示丹參酮ⅡA能夠通過激活急性心肌梗死大鼠心肌組織SDF-1/CXCR4軸，促進相關蛋白的表達，進而改善急性心肌梗死大鼠的疾病狀態及進展。

圖2 各組大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平

3 討論

急性心肌梗死是指冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，通常多為在冠狀動脈不穩定斑塊破裂、糜爛及內皮損傷基礎上繼發血栓形成，導致冠狀動脈急性、持續、完全閉塞，血供急劇減少或中斷，從而導致心肌細胞缺血、損傷和壞死過程的臨床綜合征。研究表明，心肌梗死的發生可以影響心肌組織SDF-1/CXCR4軸及相關蛋白的表達，進而引起壞死心肌組織進一步惡化，加重心肌細胞炎性浸潤，嚴重影響疾病轉歸及預后[1-4]。

SDF-1/CXCR4軸廣泛表達于機體的多種組織細胞中，且與血管生成、成骨分化、胚胎發育、神經修復等多種生理功能密切相關。SDF-1/CXCR4軸參與調控BMSCs定向分化，修復大鼠急性脊髓損傷，并參與調控間充質干細胞定向分化，修復缺氧缺血性腦損傷，在心肌梗死大鼠心肌組織中，SDF-1/CXCR4軸及相關蛋白表達會發生波動性變化，且可能與心肌梗死的進展及預后密切相關[5-8]。

TNF-α、IL-6及IL-1β是機體內重要的炎癥標志物，當心肌梗死發生時，這些炎癥因子水平能夠間接反映心肌細胞的炎癥狀態。Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3是與細胞凋亡相關的基因，其表達水平可以間接反映細胞的凋亡狀態。有研究表明，SDF-1/CXCR4軸的激活能夠抑制體內TNF-α、IL-6及IL-1β等炎癥因子的釋放，并阻止炎癥因子與受損組織相關靶點結合，進而抑制炎癥反應的發生，同時抑制細胞促凋亡基因Bax、Caspase-12和Caspase-3的表達，促進抗凋亡基因Bcl-2等的表達，抑制細胞凋亡，緩解組織損傷，加速組織自我修復[4-6]。

丹參酮ⅡA是從傳統中藥材丹參的干燥根及根莖中提取得到的一種單體化合物。近年研究表明，丹參酮ⅡA能夠改善冠狀動脈血循環，修復血管內皮細胞，抗動脈粥樣硬化斑塊的形成，抗心肌肥厚，防止糖尿病并發癥等。丹參酮ⅡA具有止痛、抗腫瘤、神經保護、血管內皮修復等多種藥理作用。研究表明，丹參酮ⅡA能夠調控外周血中SDF-1/CXCR4軸，影響2型糖尿病患者的疾病進展及預后[9-12]。而丹參酮ⅡA通過調節SDF-1/CXCR4軸對急性心肌梗死大鼠的作用及機制目前尚不明確。

本文采用結扎冠狀動脈血管的方法建立急性心肌梗死大鼠模型，研究不同劑量的丹參酮ⅡA對急性心肌梗死大鼠的作用及機制。結果顯示，與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組急性心肌梗死大鼠體內TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及心肌組織Bax、Caspase-12、Caspase-3 mRNA水平均顯著降低，Bcl-2水平顯著升高，LVEDV、LVESV均顯著降低，LVEF顯著升高。結果表明，丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴性地顯著降低急性心肌梗死大鼠體內炎癥因子水平，改善急性心肌梗死大鼠體內炎癥狀態；改善急性心肌梗死大鼠血流動力學變化，降低心臟前后負荷，改善心肌梗死大鼠左心室射血分數，緩解大鼠疾病進展，改善心肌梗死大鼠疾病轉歸；同時能夠呈劑量依賴性地抑制急性心肌梗死大鼠心肌組織凋亡相關基因的表達，促進抗凋亡基因的表達，抑制急性心肌梗死大鼠心肌細胞的進一步壞死。組織病理學檢查表明，丹參酮ⅡA能夠顯著改善急性心肌梗死大鼠組織病理學變化，提示丹參酮ⅡA能夠顯著改善急性心肌梗死大鼠心肌組織病理學改變，降低心肌組織炎癥水平，修復受損心肌肌纖維，恢復大鼠心肌組織細胞功能，緩解心肌梗死大鼠疾病進展，改善疾病預后，Western blot結果表明，丹參酮ⅡA各劑量組大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平顯著升高，提示丹參酮ⅡA能夠通過激活急性心肌梗死大鼠心肌組織SDF-1/CXCR4軸，促進相關蛋白的表達，進而改善急性心肌梗死大鼠的疾病狀態及進展。

綜上所述，丹參酮ⅡA能夠抑制急性心肌梗死大鼠體內炎癥反應，調節心肌細胞凋亡相關基因的表達，從而發揮對急性心肌梗死大鼠的保護作用，其機制可能與激活急性心肌梗死大鼠體內SDF-1/CXCR4軸有關。