基于HPLC-QAMS法對清熱通淋丸中7種成分的質(zhì)量控制研究

劉德軍，賀 玲，樊苗苗，陶弘武，王艷榮

0 引言

清熱通淋丸由爵床、苦參、白茅根、硼砂4味藥材按照中醫(yī)理論配伍而成，主要用于下焦?jié)駸崴聼崃芤约凹毙韵履蚵访谀蛳蹈腥舅滦”泐l急、尿道刺痛、尿液混濁、口干苦等的治療。清熱通淋丸方中苦參清熱、燥濕、利尿，為其君藥；爵床清熱解毒、和中化濕，白茅根清熱利尿，硼砂清熱解毒，諸藥合用，共達(dá)清熱、利濕、通淋的臨床功效。苦參為豆科槐屬植物苦參的干燥根，主要含有生物堿和黃酮類成分，具有清熱、燥濕、利尿的功效，苦參醇I、苦參酮和槐屬二氫黃酮G等異戊烯基黃酮類以及三葉豆紫檀苷、高麗槐素等紫檀素類為其黃酮類代表性成分；爵床為爵床科植物爵床的干燥全草，主要含有木脂素及其苷類等化學(xué)成分，其中6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B等為其木脂素類代表性成分。中藥及其制劑所含組分復(fù)雜，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報道[1]僅對方中苦參所含苦參堿和氧化苦參堿進(jìn)行質(zhì)量控制研究，而苦參同屬近緣藥材如山豆根等藥材中也含有苦參堿和氧化苦參堿等成分，專屬性不強(qiáng)。單一成分難以全面評價中成藥復(fù)方制劑的整體質(zhì)量，多指標(biāo)成分含量測定的質(zhì)量評價模式越來越被推廣和認(rèn)可，因此，筆者采用高效液相一測多評法[2]，對清熱通淋丸中三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的含量進(jìn)行同時測定，旨在更加全面地評價清熱通淋丸的產(chǎn)品質(zhì)量，為進(jìn)一步完善清熱通淋丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供試驗參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀，配備SPD-10Avp plus可變波長檢測器(日本島津公司)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；BT25S型電子天平(賽多利斯公司)；Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試藥 三葉豆紫檀苷對照品(批號：PRF8041446，CAS號：6807-83-6，含量：99.4%)和苦參醇I對照品(批號：PRF8032701，CAS號：99119-69-4，含量：98.0%)均來源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；苦參酮對照品(批號：18060822，CAS號：34981-26-5，含量：97.7%)、槐屬二氫黃酮G對照品(批號：18060622，CAS號：34981-24-3，含量：99.7%)、6′-羥基爵床脂素B對照品(批號：17062622，CAS號：145726-39-2，含量：98.0%)和6′-羥基爵床脂素A對照品(批號：17030623，CAS號：145971-08-0，含量：95.0%)均來源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；爵床脂素B對照品(批號：18062021，CAS號：17951-19-8，含量：98.0%)來源于上海雙福生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；清熱通淋丸(規(guī)格：每丸重0.16 g，批號：190201、190303、190603)來源于吉林省通化博祥藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 單組分對照品母液和混合對照品溶液的制備 精密稱取三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B對照品適量，用甲醇分別制成0.182、0.378、1.134、0.258、0.296、0.512、0.818 mg/ml的7種單組分對照品母液。精密吸取7種單組分對照品母液各2.5 ml，用甲醇制成三葉豆紫檀苷9.1 μg/ml、苦參醇I18.9 μg/ml、苦參酮56.7 μg/ml、槐屬二氫黃酮G 12.9 μg/ml、6′-羥基爵床脂素B 14.8 μg/ml、6′-羥基爵床脂素A 25.6 μg/ml 和爵床脂素B 40.9 μg/ml的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備 取清熱通淋丸20粒，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇25 ml，稱重，加熱回流提取60 min，放冷，用甲醇補(bǔ)重，0.45 μm微孔濾膜過濾，制成清熱通淋丸供試品溶液。依據(jù)國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ05982009中清熱通淋丸的工藝處方分別制備缺苦參、缺爵床的2種陰性樣品，再按上述方法分別制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱；乙腈(A)-水(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～9.0 min，35.0%A；9.0～21.0 min，35.0%A→42.0%A；21.0～39.0 min，42.0%A→58.0%A；39.0～45.0 min，58.0%A→35.0%A)；波長切換：0～21.0 min在295 nm波長處檢測三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮和槐屬二氫黃酮G[3]，21.0～45.0 min在256 nm波長處檢測6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B[4-5]；流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μl。在上述色譜條件下，精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液以及“2.1.2”項下各溶液分別依法進(jìn)樣檢測，測定結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，7種待測成分三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B與相鄰雜質(zhì)峰均能達(dá)到有效分離，分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計均≥4 500，陰性樣品對清熱通淋丸中三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的定量測定無干擾。

圖1 混合對照品(A)、清熱通淋丸(B)、苦參陰性樣品(C)和爵床陰性樣品(D)的HPLC色譜圖注：1.三葉豆紫檀苷，2.苦參醇I，3.苦參酮，4.槐屬二氫黃酮G，5.6′-羥基爵床脂素B，6.6′-羥基爵床脂素A，7.爵床脂素B

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 分別精密吸取“2.1.1”項下7種單組分對照品母液適量，用甲醇分別制成三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B 25倍質(zhì)量濃度差的6個系列混合對照品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行檢測，記錄各成分色譜峰峰面積，以三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 7種成分線性關(guān)系和線性范圍

2.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗 取“2.1”項下混合對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測得三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B峰面積的RSD分別為1.13%、0.96%、0.52%、1.08%、1.01%、0.81%和0.68%，表明該儀器精密度良好。取同一批次清熱通淋丸樣品，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面積，計算得7種待測成分含量的RSD分別為1.85%、1.59%、0.92%、1.74%、1.68%、1.47%和1.30%，表明該方法重復(fù)性良好。臨用新配1份清熱通淋丸供試品溶液，于0、2、4、6、12、18和24 h依法進(jìn)樣檢測三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面積，結(jié)果清熱通淋丸供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，7種待測成分峰面積的RSD分別為1.09%、0.94%、0.55%、1.11%、1.03%、0.79%和0.67%。

2.5 加樣回收率試驗 取三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B含量已知的同一批次清熱通淋丸樣品適量，研成細(xì)粉，取9份，每份0.5 g，精密稱定，隨機(jī)分成3組，按照中國藥典2015年版四部規(guī)定要求，分別精密加入混合對照品溶液(三葉豆紫檀苷0.065 mg/ml、苦參醇I 0.143 mg/ml、苦參酮0.407 mg/ml、槐屬二氫黃酮G 0.099 mg/ml、6′-羥基爵床脂素B 0.107 mg/ml、6′-羥基爵床脂素A 0.171 mg/ml和爵床脂素B 0.278 mg/ml)1.0、2.0和3.0 ml各一組，再按“2.1.2”項下方法制成加樣供試品溶液，依法進(jìn)樣測定三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面積，計算7種待測成分的加樣回收率，結(jié)果表明，所測成分三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的平均加樣回收率及RSD分別為97.99%(1.42%)、98.44%(0.85%)、99.47%(0.92%)、96.98%(1.21%)、99.50%(0.74%)、100.00%(1.04%)和98.39%(1.32%)。

2.6 相對校正因子的測定 精密吸取“2.3”項下6個系列混合對照品溶液依法進(jìn)樣測定，記錄三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面積，以苦參酮為內(nèi)參物，按計算公式：fk/s=fk/fs=(XkYs)/(XsYk)(式中X為質(zhì)量濃度，Y為峰面積，k為內(nèi)參物，s為其他待測成分)分別計算三葉豆紫檀苷、苦參醇I、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 各成分的相對校正因子

2.7 相對校正因子耐用性考察

2.7.1 不同儀器、不同色譜柱 精密吸取“2.1.1”項下的混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面積，對比考察Shimazu LC-20AT型、Agilent 1260型高效液相色譜儀和Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子的影響

2.7.2 不同流速 精密吸取“2.1.1”項下的混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面積，對比考察不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 ml/min)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同流速對相對校正因子的影響

2.7.3 不同柱溫 精密吸取“2.1.1”項下的混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的峰面積，對比考察不同柱溫(28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.8 待測組分色譜峰的定位 精密吸取“2.1”項下的混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B色譜峰的保留時間，采用相對保留時間值法(各待測成分與內(nèi)參物苦參酮色譜峰保留時間的比值)對待測成分色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見表6。

表6 各成分的相對保留時間值

2.9 一測多評法(QAMS)與外標(biāo)法(ESM)測定結(jié)果比較 取清熱通淋丸樣品3批，按“2.2”項下方法制備清熱通淋丸樣品溶液，在上述色譜條件下，進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法和一測多評法分別計算三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的含量。測定結(jié)果見表7。

表7 各成分含量測定結(jié)果 (mg/g)

3 討論

3.1 供試品提取方式的確定 本試驗在確定供試品制備方法時，首先對不同提取溶劑(95%乙醇[6]、甲醇[7-8]、50%甲醇)進(jìn)行對比考察，以清熱通淋丸中待測成分三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的綜合提取率為主要指標(biāo)，同時兼顧雜質(zhì)峰數(shù)量，結(jié)果顯示，以甲醇為提取溶劑時，待測目標(biāo)成分綜合提取率最佳，雜質(zhì)成分干擾較少；其次對不同提取方式(超聲提取法[7-8]、加熱回流提取法[5-6])進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，兩種提取方法下待測成分6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的提取效果差異不大，但三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G的提取效果加熱回流提取明顯優(yōu)于超聲提取結(jié)果，可能與清熱通淋丸中三分之二處方量苦參細(xì)粉直接入藥有關(guān)，最后通過對提取時間的不斷優(yōu)化，最終確定以甲醇加熱回流提取60 min作為清熱通淋丸供試品溶液的制備方法。

3.2 檢測波長的確定 采用二極管陣列檢測器在190～400 nm下對待測成分對照品溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮和槐屬二氫黃酮G在280 nm和295 nm波長處有較大吸收，但295 nm波長處的響應(yīng)值較大，靈敏度高；6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B在256 nm和303 nm波長處有較大吸收，但256 nm處響應(yīng)值較大，故最終確定在295 nm波長處檢測三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮和槐屬二氫黃酮G，在256 nm波長處檢測6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B。

3.3 色譜條件流動相的選擇 本試驗參考相關(guān)文獻(xiàn)對比考察了乙腈-水[3-6]、甲醇-水[7-9]兩個流動相系統(tǒng)。以清熱通淋丸中待測成分三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B的分離效果為主要指標(biāo)，同時兼顧色譜圖基線平穩(wěn)情況以及分析檢測時間等因素。結(jié)果顯示，乙腈-水流動相系統(tǒng)優(yōu)于甲醇-水體系，同時對流動相比例進(jìn)行不斷摸索，最終確定采用乙腈-水為流動相按照正文中洗脫程序?qū)η鍩嵬芡柚写郎y成分三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B含量進(jìn)行同時測定。

3.4 目標(biāo)測定成分的選擇 清熱通淋丸由爵床、苦參、白茅根、硼砂4味中藥材加工而來，在試驗過程中，筆者曾嘗試對方中藥味白茅根所含主要成分進(jìn)行定量測定，結(jié)果清熱通淋丸中所含香草酸、對羥基肉桂酸等成分含量極低，不宜作為定量控制指標(biāo)成分，故最終選取爵床所含代表性成分6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B，苦參所含主要有效成分三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮和槐屬二氫黃酮G為定量測定目標(biāo)成分。

4 結(jié)論

本試驗首次采用一測多評法對清熱通淋丸中三葉豆紫檀苷、苦參醇I、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、6′-羥基爵床脂素B、6′-羥基爵床脂素A和爵床脂素B含量進(jìn)行同時測定，建立了清熱通淋丸多指標(biāo)質(zhì)量控制模式，所建立的方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，較傳統(tǒng)的多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式降低了檢驗成本，為全面評價清熱通淋丸的內(nèi)在產(chǎn)品質(zhì)量，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和臨床療效的一致性提供了試驗數(shù)據(jù)支持。