甘草甜素對小鼠角膜急性堿燒傷后新生血管的抑制作用

王培紅，李凌菡，周永瑩，應 銘，王玉川，李 靜，李 軒，

0引言

角膜是位于眼球最前部的透明、無血管的組織，在眼的屈光系統中占有重要地位。正常角膜能夠維持透明無血管并處于“免疫赦免”狀態，角膜損傷修復過程伴隨新生血管的形成對感染的清除及組織損傷修復具有一定意義。但當角膜促血管生成因子和抑血管生成因子平衡被打破后，新生血管萌芽并異常侵入角膜基質[1]。新生血管長入角膜緣內1.0～2.0mm時，稱為角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)[2]。CNV是目前最主要的致盲原因之一，是難治性角膜疾病及角膜移植晚期最棘手的難題，也是角膜移植排斥反應發生的高危因素[3]。CNV形成的確切機制尚不清楚，目前有炎癥、缺氧及細胞因子等假說[4-5]的提出，為進一步明確其形成機制提供了理論依據。血管內皮生長因子(VEGF)在新生血管生成的過程中占據主導地位，它與受體結合后發揮其生物學效應，從而促進新生血管的形成[6]，因此抗VEGF療法是目前眼科血管相關性疾病的主要療法。然而，炎癥反應是導致血管異常增生的關鍵因素[7]，無論是在角膜新生血管的臨床治療還是在動物實驗中，抗VEGF療法均效果欠佳。因此，有效防治CNV仍是眼科學的一大難題。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是一種由壞死細胞釋放，在炎癥級聯反應中發揮重要作用的細胞因子。研究表明，HMGB1在角膜炎、葡萄膜炎、青光眼和視網膜變性疾病中可作為炎癥因子參與并加重炎癥反應[8]。因此，抑制HMGB1的表達可為疾病的治療提供一種新的思路。目前，HMGB1在CNV中的研究仍鮮有報道。本研究探討HMGB1抑制劑甘草甜素(Glycyrrhizin，Gly)對小鼠角膜堿燒傷后CNV的抑制作用。

1材料和方法

1.1材料SPF級健康8～10周齡的雄性C57BL/6J小鼠90只，體質量18～25g，協和醫學院血液學研究所提供。本研究嚴格遵循《實驗動物管理條例》(2017修訂版)的規定。甘草甜素(日本Sigma公司)，使用PBS配制成濃度為2g/L的溶液[9]，左氧氟沙星滴眼液(日本參天制藥有限公司)，鹽酸丙美卡因滴眼液(比利時Alcon公司)，CD34單克隆抗體(1∶1000稀釋，sc-18917，Santa Cruz公司)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗體試劑盒(即用型，GT203207，上海基因科技有限公司)，眼科手術顯微鏡(德國ZEISS公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及處理裂隙燈顯微鏡下觀察排除眼前節及附屬器病變。采用隨機數字表法將造模成功的60只C57BL/6J小鼠隨機分為Gly組和PBS組，每組各30只。正常對照組(30只)給予生理鹽水隔天結膜下注射，Gly組給予2g/L甘草甜素溶液，PBS組給予PBS溶液。所有藥物用量均為10μL/次，共計14d。

1.2.2角膜堿燒傷模型制作60只C57BL/6J小鼠右眼制作堿燒傷模型[10]。造模方法為兩組小鼠按照10mL/kg標準腹腔注射50g/L水合氯醛進行麻醉，生理鹽水沖洗右側結膜囊，用鹽酸丙美卡因滴眼液局部點眼3次。將直徑2.0mm的單層圓形濾紙片浸于1mol/L氫氧化鈉溶液中60s，去除多余液體后迅速貼于小鼠角膜中央，計時40s后取下，立即用生理鹽水沖洗1min。造模前后3d所有小鼠常規應用左氧氟沙星滴眼液以防感染，4次/d，1滴/次。每日裂隙燈顯微鏡下觀察各組小鼠眼表情況。排除發生角膜感染、穿孔及前房出血等并發癥，并及時補充造模小鼠。

1.2.3角膜炎癥反應評分造模后第3、7、14d在裂隙燈顯微鏡下觀察小鼠角膜炎癥反應情況。炎癥指數計算方法參考文獻[11]。角膜緣血管環充血程度：(1)無充血，0分；(2)角膜緣血管環輕度充血但寬度小于1mm，1分；(3)角膜緣血管環中度充血且寬度1～2mm，2分；(4)角膜緣血管環重度充血且寬度超過2mm，3分。中央角膜水腫程度：(1)無水腫，0分；(2)有但虹膜紋理清晰，1分；(3)有且虹膜紋理不清晰；有且瞳孔不可見，3分。周圍角膜水腫程度：(1)無水腫，0分；(2)有但虹膜紋理清晰，1分；(3)有且虹膜紋理不清晰；有且虹膜不可見，3分。炎癥指數為角膜緣血管環充血程度、中央角膜水腫程度和外周角膜水腫程度三項得分總和除以9的數值。評分由同一人完成，采用單盲觀察法。

1.2.4角膜CNV面積造模后每天在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜情況并拍照，測量并計算第7、14d的CNV面積。測量時以新生血管連續彎曲度最小且朝向角膜中央的最長血管為準。CNV面積(mm2)=C/12×π×[r2-(r-l)2]。其中，C表示新生血管侵及的圓周鐘點數，r表示角膜半徑，l表示新生血管的平均長度[12]。

1.2.5組織病理學檢查造模后第14d，將每組小鼠用頸椎脫臼法處死，摘除眼球，經40g/L多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋后做垂直于角膜表面連續4μm切片。HE染色觀察角膜組織結構，免疫組織化學染色檢測中性粒細胞數及血管內皮微血管數。顯微鏡下觀察并拍攝圖像，使用Image Pro Plus 6.0對血管內皮及中性粒細胞進行計數，計算中性粒細胞數及微血管密度(micro vascular density，MVD)。中性粒細胞計數方法：每組隨機選取角膜切片，在200倍顯微鏡下隨機計數4個不重復視野中MPO染色陽性的中性粒細胞數，取平均數即為中性粒細胞數。MVD計算方法[3]：每組隨機選取角膜切片，在400倍顯微鏡下隨機計數5個不重復視野中CD34染色陽性的微血管數，取平均數后除以400倍鏡的視野面積(0.24mm2)，即MVD=(400倍視野下的微血管數/0.24)條/mm2。計數由同一人完成，采用單盲觀察法。

2結果

2.1角膜炎癥指數情況兩組小鼠造模后不同時間點角膜炎癥指數比較，具有組間差異性和時間差異性(F時間=82.129，P時間<0.001；F組間=200.97，P組間<0.001；F組間×時間=39.848，P組間×時間<0.001)，見表1、圖1。造模后第3d，Gly組角膜炎癥指數與PBS組接近，差異無統計學意義(t=1.414，P>0.05)；造模后第7、14d，Gly組角膜炎癥指數低于PBS組，差異有統計學意義(t=7.060，P<0.05；t=9.739，P<0.05)，表明Gly組炎癥反應輕于PBS組。隨著時間的延長，Gly組角膜炎癥反應減輕，造模后第7d角膜炎癥指數與第3d比較，差異有統計學意義(P<0.001)，第14d角膜炎癥指數分別與第3、7d比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。PBS組造模后第7d角膜炎癥指數與第3d比較，差異無統計學意義(P>0.05)，第14d角膜炎癥指數分別與第3、7d比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖1 堿燒傷后不同時間點小鼠角膜炎癥指數。

表1 兩組小鼠堿燒傷后角膜炎癥指數的比較 分)

2.2角膜新生血管生長情況造模成功的標準：角膜淺層水腫，明顯混濁，呈磨玻璃樣；角膜實質受損傷，虹膜可見，但紋理不清，瞳孔隱可見；角膜緣和結膜部分缺血壞死[13]，見圖2。兩組小鼠造模后第3d，角膜緣見血管明顯擴張，新生血管開始萌芽；第7d，有新生血管長入燒傷區，新生血管面積明顯增大，PBS組角膜新生血管范圍較大，Gly組新生血管分布稀疏，Gly組CNV面積(4.16±0.00mm2)低于PBS組(7.58±0.20mm2)，差異有統計學意義(t=-52.290，P<0.001)；第14d，PBS組新生血管呈垂柳狀生長，已達角膜中央，Gly組僅見少量較長的新生血管，小細血管基本萎縮，Gly組CNV面積(7.33±0.13mm2)小于PBS組(9.24±0.08mm2)，差異有統計學意義(t=-39.376，P<0.05)，見圖3。隨著時間的延長，Gly組CNV面積增大，造模后第14d與第7d比較，差異有統計學意義(t=-76，P<0.001)；PBS組第14d與第7d比較，差異有統計學意義(t=-23.64，P<0.001)，見圖4。

圖2 堿燒傷實驗小鼠造模后角膜情況(×16)。

圖3 堿燒傷實驗小鼠造模后角膜新生血管生長情況(×16)。

圖4 堿燒傷后不同時間點小鼠角膜新生血管生長情況 aP<0.05, bP<0.01 vs PBS組。

2.3角膜病理形態改變造模后第14d，用小鼠角膜組織制片并行HE染色，顯微鏡下觀察可見正常對照組角膜結構完整，未見新生血管形成及炎癥細胞浸潤；Gly組角膜新生血管數量及炎癥細胞浸潤較少，膠原排列較規則；PBS組角膜基質可見大量炎癥細胞浸潤及新生血管，見圖5。

圖5 堿燒傷實驗小鼠造模后第14d角膜組織的HE染色結果(×200) A：正常對照組；B：PBS組；C：Gly組。箭頭示新生血管。

2.4角膜組織微血管密度微血管密度(MVD)是評價血管生成的指標，CD34作為血管內皮細胞的特異性標記物[14]，它的表達有助于進行MVD的定量分析，顯色為棕黃色或棕褐色，無背景著色。造模后第14d，兩組角膜基質層中均可觀察到呈棕褐色CD34表達陽性的微血管(圖6)，但Gly組MVD(11.13±1.46條/mm2)低于PBS組(34.08±2.46條/mm2)，差異有統計學意義(t=24.260，P<0.001)。

圖6 堿燒傷實驗小鼠造模后第14d免疫組織化學染色法檢測角膜組織中CD34表達(×400) A：正常對照組；B：PBS組；C：Gly組。箭頭示CD34陽性的血管內皮細胞。

2.5角膜組織中性粒細胞的浸潤情況MPO是中性粒細胞的特異性蛋白，檢測MPO的表達可反應角膜內中性粒細胞浸潤的情況。免疫組織化學染色結果顯示，正常角膜基質層中無中性粒細胞浸潤。造模后第14d，兩組角膜基質層中均可觀察到呈棕褐色MPO表達陽性的中性粒細胞，見圖7。中性粒細胞主要聚集在角膜基質中的新生血管周圍；Gly組角膜基質層的中性粒細胞數量為每200倍視野17.50±1.98個，較PBS組(59.56±4.79個)明顯減少，差異有統計學意義(t=22.953，P<0.001)。

圖7 堿燒傷實驗小鼠造模后第14d免疫組織化學染色法檢測角膜組織中MPO的表達(×200) A：正常對照組；B：PBS組；C：Gly組。箭頭示浸潤的中性粒細胞。

3討論

CNV可能由多種病因引起，如配戴隱形眼鏡、角膜感染和炎癥、化學損傷及角膜緣干細胞缺乏等導致的眼表疾病等[15-16]。其中在諸多的角膜外傷中，堿性化學物質燒傷引起的CNV與視力喪失的關系最為密切。堿燒傷產生的變性蛋白可作為抗原刺激機體產生特異性抗體并形成免疫復合物，誘導中性粒細胞及淋巴細胞的早期浸潤并產生趨化因子，加速巨噬細胞的浸潤，巨噬細胞產生的VEGF能夠誘導新生血管的形成。

HMGB1是危險相關分子模式(DAMPS)或警告素家族的成員之一，是炎癥性疾病的遲發調節因子。細胞壞死后，HMGB1由細胞核釋放至細胞質，最后釋放到胞外。在細胞外，HMGB1作為一種促炎細胞因子，通過結合高級糖化終產物(RAGE)、toll樣受體(TLR)-2和TLR-4而發揮其生物學效應。研究表明，HMGB1在組織損傷中可能發揮促血管生成因子的作用，具有直接或間接促血管生成活性，能刺激內皮細胞的萌發、增殖和趨化[17]。

Gly是一種天然的三萜乙二醇結合物，主要存在于甘草的根和莖中，由于其具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等多種藥理作用[18-19]。在日本，Gly被用于治療肝病尤其是慢性肝炎[20]；也有報道表明Gly具有抑制多種病毒的作用，如HIV-1[21]、雛鴨病毒性肝炎病毒(DHV)[22]、SARS相關性冠狀病毒FFM-1和FFM-2[23]。最新研究結果表明，Gly有望單獨或與其他藥物聯合治療2019新型冠狀病毒[24]。Gly是HMGB1的特異性抑制劑，可以抑制HMGB1的細胞因子活性、HMGB1刺激的細胞增殖和遷移以及HMGB1誘導的血管形成并減輕炎癥反應[25]。近年來，炎癥與新生血管的研究逐漸成為新生血管形成機制及其治療的主要方向。有研究表明抑制NF-κB通路可以抑制腫瘤壞死因子(TNF-α)、趨化因子配體CCL2和CXCL5及VEGF的產生，減少單核細胞和中性粒細胞的聚集，從而減輕炎癥反應，抑制病理性新生血管的形成[26]。鄒志康等[3]通過觀察大鼠角膜急性堿燒傷后炎癥反應評分和新生血管生長并通過HE染色及免疫組織化學染色CD34計算MVD，發現吡非尼酮能減輕大鼠角膜急性堿燒傷后的角膜炎癥反應，并抑制CNV形成。Shah等[27]研究表明Gly作為中藥甘草的主要成分能夠抑制兔CNV生成并改善堿燒傷導致的角膜基質排列紊亂，但其作用機制等仍缺乏更多的證據支持。

本研究采用與人類功能基因同源性更高的C57BL/6J小鼠來制作堿燒傷動物模型，能更好地模擬人角膜堿燒傷后的病理狀態，便于觀察新生血管的生長狀況。小鼠堿燒傷誘導的CNV模型屬于炎癥性模型，是研究炎癥性新生血管的發生機制和治療的重要手段[28]。從造模后第7d開始，Gly能明顯減輕堿燒傷后角膜的炎癥反應程度；造模后第14d，Gly組的角膜僅見少量較長的CNV，小細血管基本萎縮，角膜透明度增加。病理切片證實，造模后第14d，Gly組角膜各層結構完整存在，基質層排列較規則，炎癥細胞浸潤較少，基質層內僅見少量新生血管生成。另外，CD34作為微血管標記，主要表達于微血管的內皮細胞內，是新生血管計數的良好指標。結果顯示，造模后第14d，Gly組角膜基質中僅見少量CD34陽性的血管內皮細胞，而PBS組角膜基質中見大量標記陽性的血管內皮細胞。此外，本研究還通過角膜炎癥指數及免疫組織化學法行MPO染色中性粒細胞并計數來反映角膜的炎癥反應情況。MPO作為一種中性粒細胞特異的氧化酶，不僅能特異性地標記中性粒細胞，而且能夠較好地反映中性粒細胞活性及機體組織炎癥的嚴重程度。結果顯示，造模后第14d，Gly組角膜基質中僅有少量MPO陽性的中性粒細胞，而PBS組角膜基質中可見大量標記陽性的中性粒細胞。

綜上所述，本研究結果表明Gly能明顯減輕小鼠角膜急性堿燒傷模型中的角膜炎癥反應，抑制角膜新生血管的形成，這有望為臨床防治CNV類疾病提供一種新的思路。