正常幼兒及不同年齡段白內障患者晶狀體中常見miRNA的表達

張 建，景瑞花，秦 莉，裴 澄，吳昌睿

0引言

白內障是世界首位致盲眼病，不同年齡段均可發病[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是包含21～25個核苷酸的內源性小分子非編碼RNA，能夠在轉錄后水平對基因表達進行調控[2]。已有研究表明，miRNA在不同年齡段白內障的發生中發揮作用，但其具體機制尚不完全明確。既往研究證實，晶狀體上皮細胞內miR-184，miR-204，miR-183，miR-181b，miR-182，miR-125b，miR-124，let-7a/b/d這10條miRNA顯著高表達[3-7]，提示其可能在晶狀體相關疾病中發揮重要作用。本研究通過檢測晶狀體中這10條常見miRNA的表達水平，比較其在正常幼兒及不同年齡段白內障患者晶狀體中的表達差異，并進行靶基因預測、GO和 KEGG富集分析，為深入研究miRNA在不同年齡段白內障發生中的作用機制提供依據。

1對象和方法

1.1對象正常幼兒晶狀體組織取自死亡8～24h的尸體眼，來源于西安交通大學醫學院第一附屬醫院角膜移植供體患兒，透明晶狀體6個，年齡1～4(平均2.2±0.6)歲；不同年齡段白內障晶狀體組織來源于幼兒(先天性白內障)、中青年、老年(年齡相關性白內障)患者手術過程中撕除的前囊膜，其中幼兒白內障患者標本6例，年齡1～3(平均2.0±0.4)歲；中青年白內障患者標本6例，年齡29～45(平均38.7±4.5)歲；老年白內障患者標本6例，年齡62～68(平均65.3±6.8)歲。正常幼兒和白內障幼兒年齡差異無統計學意義(t=0.535，P=0.605)，幼兒、中青年和老年白內障患者各組間年齡差異有統計學意義(t=-16.892、-61.324、-21.432，均P<0.05)。所有病例均排除其他眼部病變，晶狀體組織均取自晶狀體前囊膜，每組標本隨機平均分為3等份，用來進行重復試驗。本研究嚴格遵循《赫爾辛基宣言》，并征得患者及/或其監護人的知情同意，獲得西安交通大學倫理委員會的批準。

1.2.1 stem-loop RT-PCR引物設計與合成miRNA檢測需要三種引物，即stem-loop RT引物、miRNA特異性正向引物和一致的miRNA反向引物。stem-loop RT引物是一段含44個堿基的特定序列之后延續6個特異性堿基，這6個特異性堿基與miRNA 3’端的6個堿基反向互補。miRNA特異性正向引物是一段特定的富含GC的序列之后延續特異性堿基，該特異性堿基是由除外miRNA 3’端8個堿基后剩余堿基組成(表1)。一致的miRNA反向引物是一段特定的堿基序列(GTGCAGGGTCCGAGGT)。miRNA引物由西安壯志生物科技有限公司合成。

表1 miRNA序列及其stem-loop RT引物和特異性正向引物

1.2.2晶狀體組織總RNA的提取(1)晶狀體組織冰上勻漿后移入1.5mL EP管中，加Trizol試劑(美國Invitrogen公司)1mL，混勻，室溫靜置5min。(2)加氯仿0.2mL，震蕩15s，室溫靜置3min，4℃、12 000g離心15min。(3)吸取上層水相0.4mL，移至另一EP管中，加0.4mL異丙醇，室溫10min，4℃、12 000g離心10min。(4)倒掉上清液，加75%乙醇(無RNA酶水配置)1mL，震蕩充分洗滌沉淀，4℃、7500g離心5min。(5)干燥后沉淀溶解于無RNA酶水中備用。

1.2.3 stem-loop RT-PCR法檢測miRNA的表達每個樣本取總RNA 1μL，2μmol/L stem-loop RT引物1μL，加入到RT體系中，震蕩溶解后短暫離心，設置反應條件為42℃ cDNA合成60min，85℃反轉錄失活5s，-20℃保存備用。將RT反應后的cDNA溶液稀釋為濃度0.5ng/μL，將miRNA正向引物和反向引物配制為濃度0.2μmol/L，取該兩種溶液各5μL，并且與10μL SYBR green混合，反應體系為20μL，反應程序為：95℃ 3min 1個循環；95℃ 15s，60℃ 30s 40個循環，從65℃開始，每5s增加0.5℃到95℃，最后4℃結束。內參采用β-actin，引物序列：F：ACTACCTCATGAAGATCCTCA，R：CAGGAGGAGCAATGATCTTGA。逆轉錄PCR試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。PCR結果分析采用2-ΔΔCt方法進行計算，分析相對表達量。

1.2.4 miRNA靶基因預測及GO/KEGG富集分析本研究使用miRWalk2(http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)在線工具預測miRNA的靶基因，然后匯總并采用R語言clusterprofiler包(http：//www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html)對預測的靶基因進行GO和KEGG通路富集分析。

2結果

2.1常見的晶狀體miRNA近年來不同研究者采用多種分子生物學技術(如Insituhybridization、Microarray等)檢測逾50種miRNA在晶狀體組織中的表達，不同方法檢測晶狀體組織中miRNA表達譜不盡相同，但部分miRNA表達豐度高且功能已經有了初步研究，文獻中已有不同研究方法檢測到了晶狀體中miRNA的表達，見表2。

表2 不同方法檢測晶狀體中miRNA的表達

2.2正常幼兒晶狀體中miRNA的表達使用stem-loop RT-PCR法檢測上述10種miRNA在正常幼兒晶狀體中的表達情況，發現所有的miRNA均可被檢測，但是表達量各不相同(F=27，P=0.000068)，其中miR-184的Ct值(miRNA Ct值與其起始含量相關，起始含量越高，Ct值越小)明顯低于其他miRNA，差異均有統計學意義(P=0.000092、0.000065、0.00043、0.00023、0.00012、0.00034、0.00056、0.00054、0.00012)，表明miR-184在正常幼兒晶狀體中含量最高(圖1)。

圖1 正常幼兒晶狀體組織中miRNA的表達 bP<0.01 vs miR-184。

2.3正常幼兒與先天性白內障幼兒晶狀體中miRNA的表達使用stem-loop RT-PCR法檢測正常幼兒與先天性白內障幼兒晶狀體中miRNA的表達，結果發現，與正常幼兒相比，先天性白內障幼兒晶狀體中6種miRNA表達升高(miR-184、miR-181b、miR-182、miR-183、miR-125b、let-7d)，其余均降低，其中miR-184、miR-182表達升高，差異具有統計學意義(t=12，P=0.0002；t=5.27，P=0.0061)，且miR-182表達升高最明顯；miR-124、miR-204表達降低，差異具有統計學意義(t=8.6，P=0.0009；t=13，P=0.00015)，且miR-204降低最明顯(圖2)。

圖2 正常幼兒與先天性白內障幼兒晶狀體中miRNA的相對表達差異 bP<0.01 vs 正常幼兒。

2.4不同年齡段白內障患者晶狀體中miRNA的表達使用stem-loop RT-PCR法檢測不同年齡段白內障患者晶狀體中miRNA的表達，結果發現，與幼兒患者相比，中青年和老年患者晶狀體中miRNA表達均有變化(miR-184：F=91.3，P=0.00070；let-7a：F=82.19，P=0.00008；miR-204：F=32.09，P=0.00055；miR-181b：F=24.05，P=0.001；miR-182：F=31.99，P=0.0006；miR-183：F=120.9，P=0.0007；miR-125b：F=8.533，P=0.0176；miR-124：F=19.00，P=0.0025；let-7b：F=10.33，P=0.0114；let-7d：F=130.9，P=0.0001)，中青年患者晶狀體中miR-204(P=0.034)、miR-124(P=0.033)、let-7d(P=0.00013)表達升高，miR-184(P=0.00009)、miR-183(P=0.0045)、let-7a(P=0.00005)表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；老年患者晶狀體中miR-204(P=0.000085)、miR-182(P=0.0076)，miR-124(P=0.003)表達升高，miR-184(P=0.00006)、miR-181b(P=0.00096)、miR-183(P=0.00015)、miR-125b(P=0.003)、let-7a(P=0.00003)、let-7b(P=0.0176，P=0.005)、let-7d(P=0.023)表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 不同年齡段白內障患者晶狀體中miRNA的相對表達差異 aP<0.05，bP<0.01 vs 幼兒。

2.5差異表達的miRNA靶基因通路富集分析由于年齡相關性白內障患者晶狀體中10條miRNA均存在表達差異，為了探索其可能的功能機制，本研究使用miRWalk在線工具預測這10條miRNA的靶基因，共計2937個，并進行靶基因的GO和KEGG富集分析。靶基因的GO分析顯示(圖4A)，細胞與基質之間的連接富集最多，提示晶狀體上皮細胞與囊袋及內層皮質之間的緊密連接在維持晶狀體正常形態及透明性方面發揮重要作用。KEGG富集分析顯示(圖4B)，腫瘤相關通路富集最多，可能是由于腫瘤中miRNA研究最廣泛所致，眾所周知，晶狀體無腫瘤性疾病。其次細胞周期排名靠前，而晶狀體上皮細胞的過度凋亡是白內障的細胞學基礎[8]，細胞周期與細胞凋亡緊密相關，進一步說明miRNA在調控白內障中發揮著重要作用。

圖4 miRNA靶基因GO和KEGG富集分析 A：10條miRNA靶基因GO富集分析；B：10條miRNA靶基因KEGG富集分析。

3討論

miRNA可調節人類基因組中約1/3基因的表達，功能涉及生物體多種生理和病理過程[9]。近年研究發現，部分miRNA在晶狀體中穩定表達，它們的功能與白內障的發生相關。本課題組之前的研究使用Microarry技術在成人正常晶狀體中檢測發現206種miRNA表達，其中miR-184表達最豐富，其后依次為let-7b、miR-923、miR-1826、miR-125b、miR-1308、miR-26a和miR-638，而在不同年齡段的白內障患者晶狀體中miRNA表達譜差異明顯[10]。不同研究報道晶狀體中miRNA表達譜不盡相同，但部分晶狀體相關的miRNA(表2)始終穩定表達。目前常見晶狀體相關miRNA的研究多集中在老年人(正常或白內障)晶狀體組織中，對其在幼兒及中青年晶狀體組織中表達的研究較少。本研究提取正常幼兒晶狀體組織總RNA，檢測其中常見晶狀體相關miRNA的表達，結果發現該類miRNA在正常幼兒晶狀體組織中均有表達，表達量各不相同，其中miR-184的Ct值明顯低于其他miRNA，表明miR-184在正常幼兒晶狀體組織中表達量最高，這與本課題組之前在成人透明晶狀體中的研究結果一致。miR-184在角膜上皮細胞中被首次報道，是角膜和晶狀體組織中顯著表達的一種miRNA，研究發現，miR-184可以抑制血管內皮生長因子(VEGF)的表達，通過維持SHIP2(SH2結構域的Ⅱ型肌醇5’磷酸酶)的水平抑制血管生長，在維持正常角膜無血管狀態中發揮重要作用。晶狀體也是眼部重要的屈光介質之一，無血管狀態保證了其基本的屈光功能，miR-184在晶狀體中的高表達可能與其能夠維持無血管狀態相關[11-12]。

此外，有研究報道多種miRNA表達與白內障的發生相關。Yao等[13]在不同生長階段鼠的晶狀體中檢測miRNA的表達，發現miR-29c可通過調節FOS影響白內障的發生；在研究晶狀體生長、衰老過程中，Chien等研究發現與組織衰老相關的miR-34a表達量與晶狀體混濁程度呈正相關，嚴重混濁的晶狀體中其表達水平較高，甚至有學者認為miR-34a可以作為白內障的一種標記物[14-15]。雖然有關miRNA調節白內障發生的研究越來越多，但在先天性白內障幼兒晶狀體中是否有miRNA表達的改變仍罕有報道。因此，本研究檢測先天性白內障幼兒晶狀體中miRNA的表達并與正常幼兒進行比較，發現在先天性白內障幼兒晶狀體中多種miRNA表達發生變化，其中miR-184、miR-182表達升高，miR-124、miR-204表達降低。既往研究報道，在晶狀體中miR-124與HuB/C/D、nPTB、REST4相互作用，能夠維持晶狀體細胞的正常特性，保持晶狀體透明[16]，同時Conte等[17]研究表明在胚胎發育早期敲除miR-204基因的動物模型會出現晶狀體異常、小眼球等體征。本研究中，先天性白內障幼兒晶狀體miR-124和miR-204表達明顯降低，這與之前的研究結果相似，進一步證實了miR-124和miR-204對維持晶狀體正常功能及特性的重要性。

為了進一步揭示miRNA在不同年齡段白內障患者晶狀體中的表達情況，我們分別對幼兒(先天性白內障)、中青年、老年(年齡相關性白內障)患者晶狀體中miRNA的表達進行了檢測，結果發現，與先天性白內障幼兒相比，中青年白內障患者晶狀體miR-204、miR-124和let-7d表達升高，miR-184、miR-183和let-7a表達降低；年齡相關性白內障患者晶狀體所有被檢測miRNA表達均有變化，其中miR-182、miR-204、miR-124表達升高，miR-184、miR-181b、miR-183、miR-125b、let-7a/b/d表達均降低。在表達差異miRNA中，已經發現miR-182在感覺器官中特異性表達，大鼠眼部組織中檢測其表達豐富，且具有重要作用[18-19]，Li等[20]發現miR-182與衰老相關，其可能通過調節RARG的表達引起細胞過早發生衰竭和死亡。衰老是年齡相關性白內障發生的根本原因，本研究發現年齡相關性白內障患者晶狀體中miR-182表達明顯高于先天性和中青年白內障患者，這進一步說明了miR-182與衰老相關，并可能在年齡相關性白內障的發生中發揮重要作用。

綜上所述，目前關于miRNA在晶狀體中表達的研究逐年增加，但尚未見正常幼兒和不同年齡段白內障患者晶狀體中miRNA表達比較的報道。本研究在正常幼兒和不同年齡段白內障患者晶狀體中檢測發現多種miRNA表達，其中miR-184在正常幼兒晶狀體中表達量最高；miR-124和miR-204在先天性白內障幼兒晶狀體中的表達明顯低于正常幼兒，分析可能與它們維持晶狀體正常功能和特性相關；年齡相關性白內障患者晶狀體中miR-182表達量明顯增加，分析可能與miR-182調節衰老相關。上述結果表明，miRNA在不同年齡段白內障發生過程中發揮不同作用，但其具體的作用機制尚待深入的研究。

1李宇博, 王峰, 蘇穎. miR-15a在眼科疾病中的研究現狀及進展. 國際眼科雜志 2020; 20(6): 999-1002