角膜緣干細胞標志物的研究進展

徐麗娜，何宇茜，張 妍，王淑榮

0引言

角膜是重要的屈光介質，角膜保持完整和透明對視力非常重要。據報道估計2015年全世界約有3600萬盲人，約有1000萬人因角膜疾病而致盲，其中角膜緣干細胞缺乏癥(limbal stem cell deficiency, LSCD)致盲是其主要原因之一[1-2]。目前對該疾病有效的治療方法是角膜緣干細胞(limbal stem cells, LSCs)移植[3]。LSCs位于角膜和鞏膜移行區，即角膜緣的Vogt柵欄區的上皮基底層[4]，維持角膜上皮的正常穩態以及修復受損的角膜，當角膜上皮損傷時，LSCs會分裂產生子代瞬時擴增細胞(transient amplifying cells，TAC)，經過增殖、遷移和分化，以取代丟失的細胞[5]。同時正常的角膜緣及其干細胞也是防止結膜上皮細胞和血管侵入角膜的屏障[6-7]。當LSCs功能失調或不足時，就會發展為LSCD—患者致盲的原因之一[8]，角膜移植是其治療的一種手段，然而由于角膜資源不足、免疫排斥反應、免疫抑制劑的終生使用等諸多原因限制了角膜移植的應用，因此探索更多的治療方法是研究者們共同的目標，而近年來LSCs移植逐漸成為研究的熱點[9]。但目前并沒有特異性的標志物可以鑒別LSCs。

1 LSCs標志物的確定標準

至今為止，還沒有統一的標準來確定哪種分子或蛋白可以作為LSCs的標志物，Pajoohesh-Ganji等[10]研究認為標志物應滿足幾個條件: (1)要為LSCs的分離和擴增提供可靠的方法；(2)在健康人體中仍然能識別LSCs，并且攜帶標記物的LSCs數量保持相對穩定；(3)在LSCD患者中，表達這些標志物的LSCs減少。

2 LSCs標志物

近年關于LSCs標志物的研究很多，它們分類方式多樣，且每種分類方式并不獨立，互相輔助，可根據LSCs標志物的表達量分為陰性標志物和陽性標志物[11]；也可以根據標志物在細胞的位置分為細胞質標志物如：角蛋白5、19 (K5、K19)、α-烯醇化酶；核標記物如：p63及表面標志物包括整合素β1、α6、α9、ATP結合盒式轉運蛋白2 (ABCG2)等[12]，有研究表明也可以具體分為細胞結構蛋白、細胞黏附因子、酶、細胞周期調節因子、生長因子及其受體、ATP結合盒式轉運蛋白、分化相關標志物等[13]。

2.1陽性標志物陽性標志物指那些相對于眼表其他部位僅在角膜緣呈現高表達的分子，包括角蛋白K5、K14、K19、波形蛋白(Vimentin)、細胞周期調節因子p63；C/EBPδ、Bmi-1、ABCG2、ATP結合盒式轉運蛋白5(ABCB5)；α-烯醇化酶；生長因子及其受體；整合素α2、β1、α6、α9；Notch-1、Importin13(IPO13)等。

2.1.1細胞結構蛋白

2.1.1.1角蛋白-K5和K14K14屬于Ⅰ型角蛋白家族的一個成員，是一種中間絲蛋白，主要表達于角膜緣上皮基底細胞。K5是Ⅱ型角蛋白，上皮細胞骨架的主要成分。通常，K14與K5形成二聚體，在細胞中共同表達，二者皆為LSCs陽性生物標志物[14]。然而，K5、K14作為角膜緣干細胞生物標記物也有局限性：首先K14的表達不限于角膜緣區域，在角膜中央也是陽性的；其次K5/K14在特定情況下可以作為LSCs的陽性標志物，有實驗研究表明：在體外培養LSCs，2wk后應用氣舉技術(air-lifting)人工促進細胞分化，由于LSCs分化狀態的動態變化，RT PCR (real-time PCR)和蛋白印記法(western blotting)結果顯示氣舉后K5 mRNA和K14蛋白表達并沒有減少，反而略有增加。這就提示K5和K14在LSCs未分化的階段才被認為是LSCs的生物標志物，在積極進行分化的細胞中，其準確性降低[15]。故K5和K14只有在特定條件下被認為是LSCs陽性標志物，而且它們并不是特異性的表達于角膜緣，這些特點限制了K5和K14作為標志物的應用。

2.1.1.2 K19和波形蛋白K19是LSCs的陽性生物標志物，在角膜緣上皮基底細胞中表達[16]，研究發現K19在結膜上皮和角膜上皮中均有表達[17]。K19和波形蛋白都屬于中間細胞絲的成員，其中波形蛋白是中間絲中最豐富的蛋白質[18]。波形蛋白在角膜緣上皮基底細胞中表達，而它通常與其他生物標志物的表達結合在一起用于識別LSCs[15]。所以K19和波形蛋白都不是特異性的標志物。

2.1.2細胞周期調節因子核蛋白p63是一種轉錄因子，在上皮的發育和再生中起著至關重要的作用，同時這種蛋白與腫瘤抑制和形態發生有關。同時作為p53家族成員，p63在細胞周期調控如細胞增殖和凋亡中起重要作用。p63在角膜緣上皮基底層表達，且在中央角膜上皮未發現表達[19]。Di Iorio 等[20]研究和分析培養LSCs，發現全克隆細胞可高表達p63，但在旁克隆細胞中未發現。p63表達6種蛋白亞型，根據是否有轉錄激活區(transactivation,TA)編碼兩組蛋白亞型TAp63(TAp63α,β和γ)和ΔNp63(ΔNp63α,β和γ), 其中 ΔNp63與LSCs的關系最密切, 正常眼表的角化細胞可能含有所有的ΔN亞型：ΔNp63α，ΔNp63β，和ΔNp63γ，它們在角膜傷口愈合過程中表達，并與角膜緣細胞遷移、角膜再生和分化相關，而ΔNp63α位于角膜緣且不在角膜上皮細胞中表達[21]。無論LSCs是靜息還是激活狀態，ΔNp63都被認為是其標志物。在靜息角膜緣，ΔNp63在基底層的小細胞簇中表達，在損傷愈合修復的過程中，ΔNp63在角膜緣基底細胞中的表達增加，這個過程似乎與C/EBPδ的失活有關[22]。并且當角膜損傷時，ΔNp63陽性細胞從角膜緣移向中央角膜。ΔNp63β和γ亞型在角膜和角膜緣的上基底層中對角膜損傷做出相應的反應，是一種分化程度更高的細胞類型[23]。另外，ΔNp63染色增強(可以稱為ΔNp63-bright cells)與臨床LSCs移植成功率有關，移植細胞中ΔNp63+細胞的含量少于3%時移植失敗的概率提高[24]。綜上所述可以認為ΔNp63是角膜緣干細胞的相對特異性生物標志物之一，而且在LSCs移植的過程中起著重要的作用。

2.1.3 C/EBPδ和Bmi1C/EBPδ是C/EBP家族的六個成員之一，在許多生物學過程中起轉錄因子的作用，包括細胞分化、運動、生長、停滯、增殖、細胞死亡、代謝和免疫反應，該蛋白功能多樣性在一定程度上取決于細胞類型和細胞環境[25]。C/EBPδ能誘導LSCs有絲分裂的靜止和自我更新，積極調節ΔNp63α的表達，維持干細胞的增殖潛能[26]。多梳基因Bmi1是PcG(polycomb group)家族重要的調控基因,該基因與干細胞的增殖、自我更新和一系列腫瘤的發生、發展及預后密切相關,中樞神經系統、末梢神經系統和造血系統的干細胞都依賴該基因進行自我更新。另外,在小鼠精原干細胞中也檢測到該基因的表達,該基因對精原干細胞的增殖也有一定的影響[27-28]。有絲分裂靜止的LSCs共同表達C/EBPδ、Bmi1和ΔNp63，這些C/EBPδ+、Bmi1+和ΔNp63+細胞約占角膜緣上皮基底層的10%。角膜損傷后，LSCs被激活，C/EBPδ和Bmi1表達下調，這激活了ΔNp63+的干細胞增殖并遷移到中央角膜修復傷口。在這個過程中，最初的增殖期LSCs繼續表達ΔNp63，但在終末分化時失去表達[29]。目前認為C/EBPδ、Bmi1可能是LSCs很有潛力的生物標志物，它們可以與ΔNp63共同標記LSCs，但更多發現有待進一步研究。

2.1.4 ATP結合盒式轉運蛋白

2.1.4.1 ABCG2ABCG2是ATP結合盒式(ATP-binding cassette，ABC)轉運蛋白家族的成員之一，是一種細胞表面蛋白，主要定位于質膜。基于Hoechst 33342染料的細胞外排原理，ABCG2+細胞能被流式細胞計分離，骨髓和骨骼肌等許多組織的干細胞基于這種染料流出原理被分離出來，這種干細胞可定義為side-population (SP)細胞[30]。從角膜緣上皮分離的SP細胞用RT-PCR方法發現其表達ABCG2 mRNA，因此ABCG2+細胞可以被認為是SP細胞的標記，但只有小部分角膜緣基底細胞表達SP細胞。ABCG2+細胞位于角膜緣上皮的基底層，也經常出現在角膜緣上皮的基底層，而在角膜上皮中則未發現表達。另外ABCG2的表達提高集落形成效率和生長能力[31]。因此根據以上研究提示這種轉運蛋白ABCG2是LSCs一個陽性標記物，而且ABCG2在角膜組織中特異性的表達于角膜緣，但只有少量LSCs表達ABCG2，并不能作為獨立的LSCs標志物。

2.1.4.2 ABCB5ABCB5是ABC轉運蛋白家族另一成員，也是P-糖蛋白(P-gp)家族的成員，是一種能量依賴的藥物外排轉運體，因此ABCB5是腫瘤多藥耐藥性的機制之一[32]。另外ABCB5與腫瘤臨床進展、治療耐藥性及復發有關[33-34]。根據以往的研究報道顯示ABCB5最先被發現于皮膚惡性黑色素瘤[35]，隨著對它的深入研究發現ABCB5在多種腫瘤中都呈現高表達，如結腸直腸癌[36]、惡性血液病[37]、肝癌[38]、乳腺癌[39]等。近年來，ABCB5已被報道是LSCs發育和修復所必需的基因[40]。ABCB5在小鼠體內與溴脫氧尿苷標簽保留的LSCs共表達，在人體內與ΔNp63α+LSCs共表達。無論是小鼠還是人類，ABCB5細胞均位于基底角膜緣上皮，在角膜上皮或結膜上皮中未發現該基因的表達。LSCD患者ABCB5呈陽性的LSCs的數量顯著降低。另外在敲除ABCB5基因的小鼠體內因其功能的缺失會引起靜止LSCs的耗盡，導致角膜分化不良和傷口愈合延遲，以上研究證明ABCB5不僅是LSCs的標記物，而且是LSCs功能所必需的基因，但目前為止并沒有大量的實驗研究證實這一結論，因此關于ABCB5的認識還需進一步的探索，這也為以后的研究提出了新的方向，讓研究者們得到新的啟發。

2.1.5細胞酶α-烯醇化酶是烯醇化酶的一種同工酶，是原核和真核細胞胞漿中的關鍵糖酵解酶，是一種多功能蛋白，既是一種胞漿蛋白，也可以作為一種纖溶酶原結合受體在不同類型的細胞表面表達[41]。據報道，α-烯醇化酶最初免疫定位于角膜緣基底細胞[12]，而且代謝增生越旺盛的干細胞表達的α-烯醇化酶越多，因此認為它可以作為LSCs的標志物。在角膜上皮清除術后上皮細胞從角膜緣基底細胞群遷移過程中，a-烯醇化酶的表達升高。近年來的研究證明，α-烯醇化酶不僅在角膜緣基底細胞中表達，也表達于基底上皮細胞[42]。另外有研究表明結膜上皮細胞也表達α-烯醇化酶，雖然α-烯醇化酶被認為是LSCs的標記物，但其特異性并不高。

2.1.6生長因子及其受體生長因子及其受體包括上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、神經生長因子 (nerve growth factor，NGF)、角質化細胞生長因子(keratinocyte growth factor receptor， KGFR)等。它們是優先定位于角膜緣基底細胞的細胞膜上的蛋白質。據報道，大鼠角膜緣上皮中未分化的細胞與角膜基底上細胞含有較高水平的EGFR[12]。應用上皮生長因子受體抗體，人和大鼠角膜的角膜緣基底細胞均有較強的膜染色。然而從外周到角膜中央EGFR免疫染色強度下降[42]。另外EGFR在角膜緣基底細胞中有很強的表達，但其染色強度在角膜緣、角膜及結膜中并無明顯差異[43]。在其他生長因子受體中，KGFR和NGF高親和力受體也優先定位于角膜緣基底細胞。此類標記物眾多，對于它們的認識仍需要更深入的分類研究。

2.1.7細胞黏附因子細胞黏附因子包括整合素α2、α3、α4、α6、α8、α9、αv、β1、β4、β5、E-鈣 粘 蛋 白 (E -cadherin)、P-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白等。整合素是由α和β亞基組成的異二聚體I型跨膜蛋白，是參與控制疾病的發展并導致癌癥和血栓形成等疾病的一種主要受體。整合素有18個α和8個β亞基，可以組裝成24個不同的受體，具有不同的結合性質和組織分布[44-45]。整合素β1、 β4、 α2、 α3、 α6和αv主要表達于基底上皮細胞層；整合素α6和β4作為半粒體的組成成分，特異地定位于基底細胞的基底膜上[44]。整合素β1和α6被認為是表皮干細胞的標記物，整合素β1在角膜緣基底細胞的染色比上基底細胞強，而且對所有角膜上皮細胞均染色；整合素α6染色見于角膜緣上基底細胞和角膜上皮細胞，而未見于角膜緣基底細胞[42]。在發育中的小鼠眼表，整合素α9定位于表皮、結膜和角膜緣的基底細胞。在人角膜中，免疫染色和RT-PCR證實整合素α9的表達僅限于部分角膜緣基底上皮細胞,而且在對損傷反應細胞遷移過程中，整合素α9在角膜上皮細胞中的表達被激活[42]。但整合素α9和β1是否是LSCs的特異性細胞表面標記物還需要進一步研究。

2.1.8 Notch-1和IPO13Notch-1是一種跨膜受體，參與維持細胞的未分化狀態，有報道認為其是LSCs的標志物。Notch-1存在于表達ABCG2的細胞亞群中，在Vogt的柵欄中與邊緣基底細胞共域化，在靜止細胞中高度表達[46]，Thomas等[47]研究發現Notch-1的表達定位于少量的角膜緣上皮基底層細胞，且所有Notch-1陽性細胞共表達ABCG2。盡管所有Notch-1細胞ABCG2均為陽性，但并非所有ABCG2陽性細胞均表達Notch-1，因此證實Notch -1作為LSCs標記物具有良好的應用前景。

IPO13是核轉運蛋白importinβ超家族新成員，是家族中唯一的雙向轉運受體蛋白，促進各種重要的細胞過程，其可以進行雙向轉運的底物包括：pax6、ubc9(ubiquitin-conjugating enzyme 9)、糖皮質激素受體、NF-YB/C二聚體等物質[48]。IPO13最初在胎鼠肺組織中發現，受激素和機體發育的雙重調控，并在腦、肺和心臟的胚胎發育過程中起著重要的調控作用[49-50]。Wang 等[51]研究發現IPO13主要在人角膜緣上皮的部分基底細胞的核內特異性高表達，在胞質內呈現弱表達，而且在角膜緣基底層、表層細胞以及中央角膜上皮細胞全層無表達，另外IPO13僅表達于角膜上皮祖細胞，在分化和成熟的角膜上皮細胞中不表達。因此可以推測IPO13將會成為LSCs有潛力、特異性高的標志物。

2.2陰性標志物陰性標志物是指不表達或僅少量表達于角膜緣基底細胞的蛋白分子，其中包括分化相關標志物連接蛋白43(connexin 43，Cx43)、角蛋白K3/12、外皮蛋白(involucrin) 等，下面論述其主要標志物。

2.2.1 Cx43縫隙連接是由六種稱為連接蛋白的跨膜蛋白組成的細胞-細胞連接，細胞間通過縫隙連接的內通道允許小分子量溶質在相鄰細胞間直接被動擴散[52]。Cx43是縫隙連接蛋白家族的成員之一，免疫熒光染色檢測Cx43在中央角膜上皮細胞和角膜緣上皮基底細胞中均有表達，而在角膜緣上皮基底細胞中未檢測到Cx43的表達，并且完全沒有Cx43表達的角膜緣基底細胞被認為是干細胞，然而那些對Cx43染色較弱的角膜緣基底細胞可能是祖細胞[53]。因此，Cx43可以被認為是人LSCs的一種陰性細胞表面標記物。

2.2.2角蛋白K3/12K3和 K12是上皮細胞內中間絲的組成成分，是一種細胞骨架蛋白，使角膜上皮細胞結構更加穩固。有實驗用單克隆抗體(AE5)檢測發現角膜中央上皮中K3+基底細胞可能比角膜緣上皮K3-基底細胞具有更高的分化狀態。另外，免疫組織化學也證明K3和K12在角膜上皮中識別出分化程度較高的細胞。從角膜緣向角膜基質遷移時，K3和K12角蛋白對的出現被解釋為干細胞向TAC的分化[54]。角膜上皮細胞分化的標志物K3在角膜緣基底上皮細胞中不表達，K12是角膜特有的，除角膜緣基底細胞外，它存在于整個角膜上皮，因此K3和K12被廣泛認為是在角膜上皮細胞、角膜緣上基底層細胞中特異性表達，而不在角膜緣基底細胞中表達[12]。這些研究證明K3和K12可以作為LSCs的陰性標志物，另外它們是細胞內蛋白，對LSCs的分離及培養等作用不大，所以目前還不是理想的標志物。

3小結和展望

本文對主要LSCs標志物進行了歸納總結(表1、2)：包括陽性標志物P63、角蛋白K5、K14、波形蛋白、ABCG2、α-烯醇化酶、整合素等，陰性標志物連接蛋白 43、角蛋白K3、K12 等，本文還介紹了最新研究的標志物ABCB5，它不僅可以標記LSCs，還可以起到修復作用，但對它的認識還需要更多的科學證明。角蛋白K5、K14、角蛋白K19和波形蛋白都屬于中間絲蛋白，其中角蛋白K5、K14在特定情況下被認為是LSCs生物標記物，而角蛋白K19和波形蛋白并非特異性標志物，另外α-烯醇化酶、整合素的特異性也備受爭議，p63是外胚層轉錄因子維持著細胞衰老和基因組穩定性，在角膜緣可特異性的檢測到ΔNp63α的表達，然而它是細胞核即胞內標志物，自體移植LSCs時進一步的富集P63純度是不可行的，這一特點限制了它的應用；ABCG2和ABCB5都是細胞表面運輸蛋白，ABCG2負責Hoechst 33342外排，但有研究表明只有小部分角膜緣基底細胞表達ABCG2。生長因子及其受體的種類眾多且復雜，特異性也不高，因此作為LSCs標志物的應用并不高。目前雖然LSCs生物標志物的很多，但在應用中都有其自身的局限性，迄今為止，最有希望成為LSCs標志物的候選為C/EBPδ、Bmi1、 ΔNp63、Notch-1，但這需要我們的進一步研究探索，而且隨著科技的發展，基于mRNA或microRNA的生物標志物的開發以及先進技術的參與，對于LSCs的準確定位以及標記將會發生在不遠的將來，這需要所有研究者的共同努力。LSCs作為一種重要干細胞來源，無論在科研還是在臨床上均有著非常重要的意義，目前為止，國內外的研究學者對LSCs生物學標志物進行了大量的研究，并取得了重大進展，對LSCs的定位越來越精確而全面，體外擴增LSCs移植則顯示了良好的應用前景，體外培養LSCs逐漸成為熱門話題，在技術上，移植最主要的問題是沒有特異性的標志物來識別LSCs，這將限制了該技術的發展，所以對LSCs標志物的確立有利于LSCs的分離和培養，對LSCD的治療有著深遠的意義。

表1 角膜緣干細胞標志物

表2 角膜緣干細胞特點