基于妊娠期糖尿病血糖控制效果對Klotho 基因表達影響的研究*

吳昌志 余星火

（江西省婦幼保健院檢驗科 南昌330006）

妊娠期糖尿病一般是指在妊娠后發生或妊娠后首次發現的糖耐量異常，是妊娠期常見的并發癥，世界各地的發生率為5%～10%[1]。隨著我國經濟飛速發展，人們生活方式發生改變，二孩政策全面開放，妊娠期糖尿病發病率明顯升高[2]。妊娠期糖尿病患者常無明顯自覺癥狀，分娩結束后，多數患者血糖會恢復，部分患者產后會發展為2 型糖尿病。然而妊娠期糖尿病對孕婦及胎兒都可產生不良影響，對母體可導致感染、產程延長、難產、羊水增多、妊高征等，對胎兒可導致巨大胎兒、宮內發育遲緩、死胎、新生兒呼吸窘迫等[3～4]。因此，積極控制妊娠期糖尿病對改善妊娠結局具有重要意義。Klotho 蛋白是一種新發現的抗衰老蛋白，參與機體多種生理、病理過程[5]。有研究發現Klotho 蛋白可參與機體能量代謝過程，我們前期的研究數據也發現Klotho 蛋白與糖化血紅蛋白呈負相關，然而Klotho 蛋白與高血糖之間的因果關系及相關機制尚無相關研究。本研究在體內外模型中探討了Klotho 蛋白在妊娠期糖尿病高血糖代謝的分子機制，為妊娠期糖尿病預防與治療提供新的潛在治療靶點。現報道如下：

1 材料與方法

1 一般資料 本研究招募研究對象103 例，均為2018 年11 月～2019 年10 月在江西省婦幼保健院定期做門診孕期檢查的妊娠人群，年齡22～48 歲，平均年齡（28±6.0）歲；孕婦于孕24～28 周行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），對陽性人群進行相應治療，并在孕32～35 周測量所有研究對象的糖化血紅蛋白（HbA1c），依據糖化血紅蛋白指標控制情況分為血糖控制不達標組（HbA1c＞6.5%）56 例，血糖控制達標組（HbA1c＜6.0%）47 例。所有入組的孕婦均為中低危人群，單胎妊娠，無高血壓、心血管疾病、肝病、腎病史，近期無外傷手術史；排除急慢性感染、呼吸系統和泌尿生殖系統炎癥疾病史，其他產科并發癥和合并癥。妊娠期糖尿病診斷標準：采用美國糖尿病協會推薦的OGTT 試驗，孕婦在孕24～28 周口服75 g 葡萄糖后，分別采集空腹，口服葡萄糖1 h 和2 h 標本進行血糖檢測，3 次血糖值分別達到或超過5.1 mmol/L、10.0 mmol/L、8.5 mmol/L 則判定為妊娠期糖尿病。

1.2 血清Klotho 蛋白水平檢測 采用人α-Klotho和β-Klotho 蛋白酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒進行檢測，分別購自欽城生物有限公司、百奧萊博有限公司，操作步驟按照商品試劑盒說明書進行。

1.3 HEK293 細胞培養 細胞培養基為DMEM（Gibco）加100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素，培養環境37℃，5%二氧化碳（CO2），高糖組采用終濃度為28 mmol/L 的葡萄糖，低糖組采用終濃度為5.5 mmol/L 的葡萄糖，細胞培養基每隔24 h 換液，培養48 h、72 h、96 h、120 h 收獲細胞。培養操作嚴格無菌操作，避免支原體等微生物感染。

1.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應法 （RT-PCR） 檢測α-Klotho 和β-Klotho 信使核糖核酸（mRNA）表達水平獲取細胞經核糖核酸（RNA）提取，互補脫氧核糖核酸（cDNA）逆轉錄后進行RT-PCR 實驗，聚合酶鏈反應（PCR）條件：α-Klotho 和β-Klotho 都采取變性95℃，15 s；退火60℃，15 s；延伸70℃，20 s，循環35 個；然后72℃，10 min。GAPDH 為內參基因，其中α-Klotho 引物GCTCTCAAAGCCCACATACTG （前引物），GCAGCATAACGATAGAGGCC（后引物）；β-klotho引物TTCTGGGGTATTGGGACTGGA（前引物），CCATTCGTGCTGCTGACATTT（后引物）；GAPDH引物GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT（前引物），GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG3'（后引物）。

1.5 統計學處理 數據處理采用SPSS17.0 統計學軟件，計數資料以%表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，非正態分布變量以四分位間距表示而后進行分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 妊娠期糖尿病血糖控制達標與不達標組α-Klotho 和β-Klotho 蛋白水平比較 血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白表達水平在妊娠期糖尿病血糖控制不達標組明顯低于達標組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組妊娠期糖尿病血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白水平比較（±s）

表1 兩組妊娠期糖尿病血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白水平比較（±s）

注：妊娠期糖尿病不達標組與達標組α-Klotho 蛋白水平相比較，*P＜0.05；妊娠期糖尿病不達標組與達標組β-Klotho 蛋白水平相比較，#P＜0.05；妊娠期糖尿病不達標組與達標組HbA1c 水平相比較，△P＜0.05。

組別 n HbA1c（%） α-Klotho（pg/ml） β-Klotho（pg/ml）不達標組達標組56 47 7.91±0.52△5.04±0.24 469±7.69*604±9.89 99±3.68#169±5.91

2.2 HEK293 細胞在不同血糖水平培養條件下α-Klotho mRNA 和β-Klotho mRNA 表 達 水 平28.0 mmol/L 組各檢測時間點HEK293 細胞α-Klotho 和β-Klotho mRNA 表達水平明顯低于5.5 mmol/L 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同血糖水平培養條件下α-Klotho mRNA 和β-Klotho mRNA 表達水平

3 討論

隨著我國經濟高速發展，人們生活條件改善，以及最近二孩政策放開，妊娠期糖尿病發病率進入了一段快速增長期[6]。研究發現，決定妊娠結局和母兒預后的因素是整個妊娠期間血糖的控制情況，而非某一時間點的血糖是否達標[7]。血糖動態監測是評估妊娠期血糖管理方案有效性的手段，但不定期的檢測血糖給孕婦生理、精神、經濟都帶來了不可小覷的影響，因此，血糖監測新標志物的研究十分迫切。之前有研究發現Klotho 蛋白可參與機體能量代謝過程，妊娠期糖尿病是一組以血糖升高、血糖利用障礙為特征的代謝性疾病，Klotho 蛋白是否與妊娠期糖尿病高血糖相關及作用機制尚無相關研究[8]。本研究發現血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白表達水平在妊娠期糖尿病血糖控制不達標組明顯低于達標組，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示Klotho 蛋白參與長期的糖代謝平衡過程，Klotho 蛋白有可能可用于妊娠期糖尿病的治療監測。

現研究已經證實，高血糖可誘導數種細胞產生活性氧并在組織蓄積，從而導致組織細胞損傷。其具體機制一方面與活性氧直接損失細胞DNA、碳水化合物和蛋白質分子有關，另一方面可能與活性氧激活細胞應激敏感性通路相關[9～10]。本研究在體外以HEK293 細胞為研究對象，發現經高血糖培養48 h、72 h、96 h、120 h 后HEK293 細胞28.0 mmol/L 組α-Klotho mRNA 和β-Klotho mRNA 表達水平明顯低于5.5 mmol/L 組，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示高血糖是導致Klotho 表達降低的原因。因此，對妊娠期糖尿病患者嚴格控制血糖可阻止Klotho 基因表達水平降低，進而減少不利于新生兒和妊娠的風險。

綜上所述，妊娠糖尿病的發病率持續升高及高血糖對妊娠結局和母兒預后均有明確不良影響。將妊娠期血糖控制于正常水平有利于減少不良妊娠結局發生，但目前的控制現狀仍有待提升，面對這一嚴峻挑戰，我們應在現有指南的基礎上，繼續挖掘一批新的標志物用于規范、診斷、監測和治療妊娠糖尿病，將患者血糖控制到正常水平，同時不斷加強妊娠期母兒產后遠期隨診工作。