超高效液相色譜—串聯質譜法快速同時檢測茶葉中7種香料An UHPLC-MS/MS

梁志森 陳玉珍 周朗君

(1. 廣州檢驗檢測認證集團有限公司，廣東 廣州 511447；2. 國家加工食品質量檢驗中心﹝廣東﹞，廣東 廣州 511447)

茶葉是世界上主要的無酒精飲品之一。茶葉的風味是評價茶葉質量和影響其售價的重要因素[1-2]，因此人們常擔心不法商家往劣質茶葉中非法添加香料以改善茶葉的香氣香型，以次充好、牟取暴利。香豆素是豆香型主要香料之一，對小鼠胚胎有毒性，對大鼠可能會誘發癌癥、中毒等不良反應[3-4]，有研究[5-6]表明在綠茶中檢出低含量的香豆素。胡椒酚甲醚是藿香、小茴香、茴香等植物的主要香氣成分[7]，可用于無酒精飲料的調味，但具有一定的基因毒性和致癌性[8]。茴香烯具有八角茴香樣味，屬于茶花屬花香氣成分[9]，是重要的食品香料，按成年人體重計每日可接受攝入量為0.0～2.0 mg/kg[10-11]。有研究[12-13]指出，攝入高劑量的茴香烯會對大鼠干細胞、人類精子功能產生不良影響。指甲花醌具有桂花香氣，廣泛用作海娜染發劑[14]，高劑量攝入可以引起小鼠溶血性貧血和腎小管壞死[15-16]，在化妝品和食品中均被禁止添加。反式肉桂醛是重要的香料和食品添加劑，具有肉桂香味，有研究[17]指出其對人體是一種敏化劑，毒性較低。

中國GB 2760—2014規定茶葉中不允許添加香料，但未規定檢測方法。根據美國《聯邦規章典集》[18](CFR)的189.180節，香豆素不能直接添加到食品中。歐盟的法規[19]嚴格限制如香豆素、蒲勒酮等香料在食品中的使用，并規定胡椒酚甲醚、甲基丁香酚在非酒精飲料中的最大允許使用限值分別為10，1 mg/kg。

氣相色譜—質譜聯用法[20-23]、液相色譜質譜聯用法[24-25]被廣泛地應用于食品中農藥殘留、污染物、禁用物質等的檢測。Bousova等[26]使用氣相色譜串聯質譜結合固相頂空微萃取法，建立了檢測食品中7種香料的方法，但未研究不同的茶葉基質且未覆蓋茴香烯、反式肉桂醛和指甲花醌等物質。Lopez等[21]使用氣相色譜—質譜的方法，檢測了4類不同食品基質中14種香料物質，分析時間長達25 min，且該試驗未覆蓋綠茶、紅茶等茶葉基質，此外，該方法對茴香烯的回收率僅有53%，難以滿足實際檢測的需求。

使用有機溶劑對茶葉中香料進行直接提取是一種簡便有效的方法。使用超高效液相色譜—串聯質譜(UHPLC-MS/MS)，可以對茶葉中非法添加的香料進行快速定性、定量分析。試驗擬基于UHPLC-MS/MS系統建立同時檢測茶葉中7種可能非法添加香料(香豆素、胡椒酚甲醚、指甲花醌、甲基丁香酚、蒲勒酮、茴香烯和反式肉桂醛)的定性、定量方法，以期提高檢測效率，節約成本，為政府監管部門及檢測行業提供有效的分析技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲勒酮、茴香烯、反式肉桂醛標準品：純度>99%，中國上海源葉生物科技公司；

香豆素標準品、指甲花醌標準品：純度>99.5%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

胡椒酚甲醚標準品、甲基丁香酚標準品：純度>99.5%，中國上海安譜實驗科技股份公司；

十八烷基鍵合硅膠(C18)吸附劑(120～400目)和N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑(40～60 mm)：上海安譜科學儀器有限公司；

無水硫酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

乙醇、乙腈、甲酸：色譜純，德國Merck公司；

其他試劑均為分析純；

Kinetex C18柱(100 mm×3.0 mm，2.6 μm)：美國菲羅門公司；

試驗用水：超純水，美國Millipore超純水儀制備；

茶葉(綠茶和紅茶各50份)：市售。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀：1290 Infinity II型，安美國捷倫科技公司；

三重四級桿串聯質譜儀：API 5500型，配電噴霧離子源(ESI)，美國AB SCIEX公司；

超純水系統：Mill-Q Gradient型，美國密理博公司；

快速均勻器：MS3型，德國IKA公司；

混合研磨儀：GM200型，德國Restch公司；

高速離心機：3K15型，德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制 分別取(20.0±0.1) mg的茴香烯、香豆素、胡椒酚甲醚、指甲花醌、甲基丁香酚、蒲勒酮和反式肉桂醛的標準品，分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈配制成2 000 mg/L的標準儲備液，并轉移至棕色瓶中。分別移取上述7種目標物的標準儲備液1 mL至10 mL 容量瓶中，配制成200 mg/L的混合標準儲備液。取混合標準儲備液，用0.1%甲酸乙腈溶液逐級稀釋成濃度為0.8，1.0，2.0，40.0，160.0，400.0，800.0，1 200.0，1 600.0 μg/L 的混合標準工作溶液，現配現用。所有標準儲備液均于4 ℃下保存。

1.3.2 樣品提取、稀釋、凈化 茶葉樣品經過充分粉碎、均勻后，過篩(300 μm)，分別獨立儲存于樣品袋中，并于4 ℃ 下保存。稱取均勻后的茶葉樣品1.00 g于玻璃比色管中，加入乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)提取溶劑并定容至10 mL，渦旋2 min(3 000 r/min)，取1 mL上清液于15 mL 離心管中，并使用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)稀釋至5 mL。于稀釋后溶液中加入5 mg PSA吸附劑、5 mg C18吸附劑和20 mg 無水硫酸鈉，渦旋振蕩2 min(3 000 r/min)，8 000 r/min離心2 min，取上清液過0.22 μm 有機微孔濾膜置于棕色進樣瓶，待測。

1.3.3 前處理條件優化 分別對樣品前處理中提取溶劑種類、提取溶劑用量、凈化劑種類、凈化劑總用量、無水硫酸鈉用量進行優化，其余步驟按照1.3.2操作。

1.3.4 質譜條件 離子源ESI，正離子掃描；氣簾氣1.38×105Pa；霧化氣(GS1) 3.45×105Pa；輔助加熱氣(GS2) 4.83×105Pa；碰撞氣(CAD) 4.83×104Pa；電噴霧電壓(IS) 5 500 V；離子源溫度(TEM) 400 ℃；在電噴霧正模式下，分別對7種目標物各個碎片進行參數采集，選擇響應強度較高的兩對碎片離子作為依據，其中響應最高的子離子作為定量離子對，通過多反應檢測MRM模式優化各個碎片離子的去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)。

1.3.5 色譜條件 色譜柱為Kinetex C18柱(100 mm×3.0 mm，2.6 μm)。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～2 min，10% B～90% B；2～4 min，90% B；4～6 min，10% B。流速0.4 mL/min，柱溫20 ℃，進樣量10 μL。

1.3.6 基質標準曲線的制備 分別稱取不含目標物的空白茶葉樣品1.00 g，按1.3.1的方法進行處理。用基質提取液稀釋標準溶液，以峰面積(Y)為縱坐標對各被測組分的質量濃度(X)為橫坐標作圖，繪制基質標準曲線。

1.3.7 回收率的計算 按照1.3.2的方法稱取均勻后的茶葉樣品，在樣品中添加30 mg/kg混合標準溶液，進行加標回收試驗，每個添加水平平行測定6次計算平均回收率。

1.3.8 精密度的計算 按照1.3.7的方法進行加標回收試驗后，在同一天內進行6次平行測定日內精密度試驗，連續3 d內進行平行測定6次日間精密度試驗。

1.3.9 數據處理 測量數據采用Analyst 1.61進行采集和處理，使用Origin 8.0進行科學作圖。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 提取溶劑種類的優化 茶湯一般使用水作為溶劑，而乙腈和乙醇是超高效液相色譜常用的提取溶劑。考慮到指甲花醌、反式肉桂醛較易溶于水，而蒲勒酮、香豆素、茴香烯等物質難溶于水。為了實現7種目標物的高效提取，以空白茶葉為基質在20 mg/kg的加標水平下，考察了乙腈、乙腈—水(V乙腈∶V水=4∶1)、乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)、乙醇—水(V乙醇∶V水=4∶1)、乙醇—水(V乙醇∶V水=1∶1)、乙醇和水7種提取溶劑對7種目標物的提取效率，結果如圖1所示。當使用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)為提取溶劑時，7種目標物的回收率均在75.2%～85.6%，基本滿足試驗的要求。當使用純乙腈、乙腈—水(V乙腈∶V水=4∶1)為提取溶劑時，胡椒酚甲醚和指甲花醌的平均回收率分別為56.2%和65.6%，而茴香烯的平均回收率達到114%，顯然不能滿足7種目標物同時提取的要求。當使用其他提取溶劑時，7種目標物的平均回收率均比使用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)時低。因此，最終選擇乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)為最佳提取溶劑。

2.1.2 提取溶劑用量的優化 根據2.1.1的試驗結果，以乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)為提取溶劑，考察2.5，5.0，10.0，25.0，50.0 mL不同提取溶劑體積對7種目標物回收率的影響，結果如圖2所示。當提取體積為2.5 mL和5.0 mL 時，香豆素和反式肉桂醛的平均回收率分別高達111.5%和97.2%，而茴香烯、胡椒酚甲醚以及指甲花醌等物質的平均回收率均低于56.0%。當提取體積為10.0 mL 時，7種目標物的平均回收率較穩定，處于74.5%～84.4%，符合方法學的要求。當提取體積為25.0 mL 和50.0 mL時，茴香烯、胡椒酚甲醚和甲基丁香酚的平均回收率逐漸變低。因此，最終選擇10.0 mL為提取溶劑的體積。

圖1 提取溶劑種類與7種目標物回收率的關系

圖2 提取溶劑體積與7種目標物回收率的關系

2.1.3 凈化劑種類的優化 茶葉的基質復雜，試驗將C18和PSA組合作為凈化劑，以去除茶葉基質中多酚、脂類、色素等干擾物。在凈化劑總質量為10 mg、無水硫酸鈉用量為10 mg時，考察了5種不同比例的C18和PSA組合(mC18∶mPSA分別為1∶4，2∶3，1∶1，3∶2，4∶1)對7種目標物回收率的影響，結果如圖3所示。當mC18∶mPSA=1∶4時，茴香烯、指甲花醌和甲基丁香酚的平均回收率均低于68.0%，當mC18∶mPSA=3∶2或4∶1時，蒲勒酮的平均回收率分別達到103.2%和115.0%，但是指甲花醌的回收率均低于62.0%。當mC18∶mPSA=2∶3時，茴香烯的平均回收率為68.0%，低于70.0%的回收率要求。僅當mC18∶mPSA=1∶1時，7種目標物的平均回收率達到76.3%～85.5%，滿足方法學的要求，且回收率更穩定。因此，選用凈化劑的組合比例為mC18∶mPSA=1∶1。

2.1.4 凈化劑總用量的優化 在無水硫酸鈉用量為10 mg 時，凈化劑的組合比例為mC18∶mPSA=1∶1，考察5個不同凈化劑總用量(5，10，20，30，40 mg)對7種目標物回收率的影響，結果如圖4所示。當凈化劑總用量為5 mg 時，茴香烯、指甲花醌的平均回收率分別為46.8%和56.2%，不能滿足試驗要求。當凈化劑總用量為30 mg和40 mg時，7種目標物的回收率差異較大，其中茴香烯、指甲花醌的回收率均低于65.0%，仍不能滿足試驗要求。當凈化劑總用量為10 mg時，7種目標物的平均回收率為75.5%～85.4%，而當凈化劑總用量為20 mg時，7種目標物的平均回收率較高且比較穩定，在80.5%～95.5%范圍內，均符合方法學的要求，因此凈化劑的用量確定為20 mg。

圖3 凈化劑種類與7種目標物回收率的關系

2.1.5 無水硫酸鈉用量的優化 無水硫酸鈉作為吸水劑和鹽析劑，能吸附水溶性干擾物，又能增強液液萃取中兩相的分離程度，有利于目標物的提取。試驗考察無水硫酸鈉的用量(5，10，20，30，40 mg)對7種目標物回收率的影響。結果顯示，當無水硫酸鈉的用量為5 mg時，指甲花醌的平均回收率僅為60.2%，不能滿足提取的要求。當無水硫酸鈉用量為10 mg和20 mg時，目標物均能獲得較高的回收率，分別為79.5%～95.0%和89.4%～100.4%，當無水硫酸鈉的用量增多時，7種目標物的平均回收率逐步下降。因此，最終確定無水硫酸鈉用量為20 mg。

圖4 凈化劑總用量與7種目標物回收率的關系

2.2 儀器條件優化

2.2.1 質譜條件的優化 試驗7種目標物的單獨標準溶液分別通過針泵注射進入質譜，在電噴霧正模式下，分別對7種目標物的各個碎片進行參數采集，選擇信號強度高的兩個碎片離子作為定性依據，其中信號最強的一對碎片離子作為定量離子對，并通過MRM模式優化各個碎片離子的相關質譜參數，具體見表1。

表1 7種分析物的保留時間和質譜參數表?

2.2.2 色譜條件的優化 為保證色譜峰峰型尖銳以及較好的分離效果，探索了不同的流動相組成和比例，最終選用0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液作為流動相，使用優化后的條件僅6 min內就能實現7種目標物的全部出峰，且滿足基線分離，試驗譜圖見圖5。

2.3 方法的驗證

2.3.1 基質效應的考察 由于茶葉基質復雜，含有脂肪、色素、酚類等可能干擾檢測結果的物質，因此需要對基質效應進行考察。用1.3.2的前處理方法對樣品進行處理，得到基質溶液，并以此基質溶液按照1.3.6的方法配制標準工作曲線得到基質匹配曲線，同時按照1.3.1的方法用0.1%甲酸乙腈溶液配制溶劑并繪制標準曲線。以7種目標物的基質曲線的斜率與純溶劑曲線斜率之比來確定基質效應(ME)，當ME的絕對值>50%時，說明基質效應明顯。正值代表基質增強作用，負值代表基質減弱作用。如表2所示，對于綠茶基質，ME數值在74.7%～105.9%；對于紅茶基質，ME數值在-5.2%～-84.1%。結果表明，對于綠茶基質，7種目標物都存在明顯的基質效應；對于紅茶基質，茴香烯和胡椒酚甲醚的基質效應明顯，因此進行定量分析時需要使用基質匹配曲線進行校正。

1. 指甲花醌 2. 香豆素 3. 反式肉桂醛 4. 甲基丁香酚 5. 蒲勒酮 6. 茴香烯 7. 胡椒酚甲醚

ME=[(Kmat/Kstd)-1]×100%，

(1)

式中：

ME——基質效應，%；

Kmat——基質匹配曲線的斜率；

Kstd——標準曲線的斜率。

2.3.2 線性范圍、檢出限、定量限、回收率和精密度 按照1.3.6的方法配制7種目標物的基質標準溶液(0.8～1 600.0 μg/L)，繪制工作曲線，得到相應的線性回歸方程，相關系數R2為0.999 1～0.999 9(見表2)，表明7種目標物在濃度范圍內呈良好的線性。試驗以外標法進行定量，以3倍信噪比(S/N)響應時所對應的質量濃度作為檢出限(LOD)，以10倍信噪比對應的質量濃度作為定量限(LOQ)。方法的檢出限范圍為0.02～0.03 mg/kg，定量限范圍為0.06～0.10 mg/kg，具體見表2。在空白綠茶和空白紅茶樣品中添加3個不同濃度水平的混合標準溶液進行加標回收試驗，每個添加水平平行測定6次計算平均回收率。日內、日間精密度試驗在同一天和連續3 d內分別進行平行測定6次。試驗結果顯示，不同茶葉基質中所有目標物的平均回收率為82.5%～102.5%；日內、日間精密度分別小于16%和18%(相對標準偏差)。具體結果見表3。

表2 0.8～1 600.0 μg/L 濃度范圍內茶葉基質中方法的標準曲線、R2、基質效應、檢出限和定量限

表3 不同茶葉基質樣品中7種待測物的回收率、日內和日間精密度

2.3.3 實際樣品檢測 應用該法對100個茶葉樣品(其中紅茶50個，綠茶50個)進行檢測，結果如表4所示。其中，茴香烯、香豆素和胡椒酚甲醚在實際樣品中有檢出，在綠茶樣品中其檢出的最高濃度分別為65.0，2.4，72.2 mg/kg；在紅茶樣品中其檢出的最高濃度分別為18.1，1.0，65.0 mg/kg，而其他5種物質均未檢出，具體結果見表4。說明市售茶葉中存在非法添加香料的情況。

表4 不同茶葉樣品中分析物的濃度?

3 結論

利用超高效液相色譜—串聯質譜系統，建立了茶葉中7種可能非法添加的香料的快速檢測方法，優化了前處理和儀器條件，并考察了不同的茶葉基質效應。方法學評價和實際樣品檢測結果表明，該方法靈敏度高，操作簡便，分析時間短，能同時對7種目標物進行準確的定性定量分析，目標物回收率較高且穩定。在市售100個茶葉樣品中檢測出茴香烯、香豆素和胡椒酚甲醚等非法添加香料，準確反映了市售茶葉中非法添加香料的實際情況，滿足實際監管的要求。