疣粒野生稻體細胞雜交后代Y73快繁技術

嚴成其，趙碩，呂嘉城，王穎，陳磊，黃迪，譚曉菁，王栩鳴，周潔，楊勇，魯宇文，黃堅，王芳，王俊敏，張志祥*

(1.寧波市農業科學研究院，浙江 寧波 315040； 2.寧波惠貞書院，浙江 寧波 315030； 3.寧波五鄉中學，浙江 寧波 315010；4. 浙江省農業科學院 農產品質量安全危害性質因子與風險防控國家重點實驗室，浙江 杭州 310021)

疣粒野生稻(Oryzameyeriana)是我國現存的3種野生稻之一，經鑒定對白葉枯的抗性達到高抗，接近免疫，其抗性持久穩定，是最為理想的抗病育種材料[1-2]。疣粒野生稻染色體組型為GG，而栽培稻染色體組型為AA，使用常規的有性繁殖難以打破其生殖隔離的障礙，是利用其優異性狀的巨大難點[3]。為了充分利用疣粒野生稻資源，課題組通過采用疣粒野生稻和栽培稻體細胞雜交的方法獲得其體細胞雜交后代，從而實現疣粒野生稻遺傳物質向栽培稻的定向轉移工作。該試驗為挖掘具有自主產權的高產抗病、優質抗逆等多項優良品種的水稻資源奠定試驗基礎。

試驗研究中由于缺少遺傳背景一致的疣粒野生稻體細胞雜交后代，難以進行抗病蟲基因研究和新種質的繁育研究。組培快繁技術因其增殖速度快，生產周期短，繁殖系數高等優點，可在短期內實現遺傳性一致的疣粒野生稻體細胞雜交后代規模化生產[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料疣粒野生稻體細胞雜交后代Y73來源于寧波市農科院生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 材料的收集與消毒

取疣粒野生稻體細胞雜交后代Y73種子，經70%乙醇消毒30 s，在0.1%升汞中搖動消毒8 min，并用無菌水沖洗3～5次。

1.2.2 Y73愈傷組織的誘導和胚性細胞的形成

取消毒后的疣粒野生稻體細胞雜交后代Y73種子置于誘導培養基上誘導愈傷組織生成。通常每隔20 d挑選胚性愈傷組織或質量好的愈傷組織進行繼代培養。預培養、誘導愈傷和繼代培養基使用MS+2.4-D 0.5～3.5 mg·L-1+6-BA 0.01～2.00 mg·L-1，誘導培養基的培養條件為溫度(25±2)℃，黑暗培養，適量增加糖、瓊脂的濃度和添加谷氨酰胺。部分非胚性愈傷組織能誘導胚性愈傷組織。

1.2.3 胚性細胞分化成綠苗

將誘導出的胚性細胞接種在MS+NAA 0.5～4.5 mg·L-1+6-BA 0.01～2.50 mg·L-1+KT 1.5～2.0 mg·L-1分化培養基中，培養條件為溫度(25±2)℃，光強2 000～3 000 lx、光照16 h·d-1。

1.2.4 小苗生根培養

將由胚性細胞分化成的小苗接種在1/2MS+IAA 0.01～0.03 mg·L-1生根培養基中，置于25 ℃、光照強度2 000 lx、光照時間16 h·d-1的環境中培養，30 d后統計植株生長情況，包括植株高度、葉片數、根數等。

1.2.5 煉苗及移栽

待綠苗在培養基中長至10 cm后，直接打開培養瓶蓋，加入少量純凈水，水量以高過培養基2 cm為宜，定時觀察續水，14 d后用溫水將綠苗充分洗凈，然后置于內含1/2MS+IAA 0.01～0.03 mg·L-1水溶液的三角瓶中，14 d后移栽到苗床。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導和胚性細胞的形成

由表1可知，將疣粒野生稻體細胞雜交后代的種子接種到MS+2.4-D 0.5～3.5 mg·L-1+6-BA 0.01～2.00 mg·L-1誘導培養基中，部分愈傷組織可在30 d左右被成功誘導，初次誘導出的愈傷組織有些是非胚性的。若在繼代培養基中提高糖和瓊脂的濃度，同時添加谷氨酰胺，能使部分愈傷組織轉變成小顆粒狀的、易碎的胚性愈傷組織。

表1 不同培養基對誘導愈傷組織和胚性細胞的影響

在同一培養基繼續培養2個月左右能誘導出胚性愈傷組織，繼續培養可建成分散性好、色澤鮮黃、細胞質濃、分裂能力旺盛的胚性細胞。其中，胚性細胞誘導成功率最優的培養基配方是MS+2.4-D 1.5～2.5 mg·L-1+6-BA 0.1～1.0 mg·L-1，成功誘導率可達11.1%～14.2%。

2.2 不同培養基濃度對體細胞雜交后代胚性細胞再生成苗的影響

設10組含有不同濃度激素的MS培養基，每組培養基接30個胚性細胞，63 d后觀察結果。表2表明，MS+NAA 1.5～2.0 mg·L-1+6BA 0.10～0.30 mg·L-1+KT 1.5～2.0 mg·L-1均可誘導成苗，成苗率可達到28.6%～40.7%。

表2 不同培養基濃度對胚性細胞再生成苗的影響

2.3 綠苗生根培養

將再生的小苗接種在1/2MS+IAA 0.01～0.03 mg·L-1培養基中，都能長出莖、根、葉完整的水稻植株，30 d后生根率達到91%。

2.4 煉苗及移栽

由于組培苗在形態和生理結構上與自然生長苗存在一定差異，為了適應移栽后的自然環境，煉苗顯得尤為重要。植株煉苗過程將組培苗從異養逐步過渡到自養，由無菌環境變為有菌環境，溫光條件也發生顯著變化。本研究表明，煉苗7 d后的10～15 cm再生小植株直接移栽在保持濕度的苗床中，1周后成活率達到90%。

3 小結與討論

水稻細胞的生長主要受大量元素、微量元素、激素、維生素、有機質、滲透壓、穩定劑等影響。植物激素是影響誘導水稻愈傷組織和胚性細胞愈傷組織最關鍵因素，2.4-D是誘導愈傷組織最重要的關鍵激素成分。隨著2.4-D濃度的升高，其愈傷組織生長加快，胚性減少。當2.4-D>3.5 mg·L-1或<1.0 mg·L-1時，都不利于水稻體細胞雜交后代的愈傷組織和胚性細胞愈傷組織的形成；6-BA<1.0 mg·L-1有利于胚性細胞的生長。已建成的胚性細胞愈傷組織中，繼代時間過長其胚性減弱，表現為細胞團周邊細胞變得粗糙，部分細胞團開始解體，形成不規則顆粒狀突起，同時出現非胚性細胞愈傷組織[6]。愈傷組織的色澤、外表對再生頻率均有一定影響，一般花菜形態、淺白色澤、結構緊密的胚性愈傷組織在合適的分化培養基中容易變綠，并長出綠芽。最初誘導出的愈傷組織，大多是非胚性的，若在繼代培養基中添加谷氨酰胺400 mg·L-1，提高瓊脂和糖的濃度分別大于10和35 g·L-1，并能使愈傷組織轉變成易碎的小顆粒狀的胚性愈傷組織[7]。胚性愈傷組織轉接到合適量的含有細胞分離素和生長素的培養基中再生小苗，小苗在低濃度IAA減半基本培養基中長根。小植株在移栽之前必須經過煉苗，與其他植物組織培養苗不同，水稻小苗可以直接移栽至水稻土壤。