楊梅對低溫脅迫的生理響應與抗寒性評價

任海英，程龍軍，胡丹，鄭錫良，張淑文，俞浙萍，戚行江

(1.浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300；3.溫州市農業技術推廣中心，浙江 溫州 325011)

楊梅(Myricarubra)是我國南方特色優勢水果之一，為楊梅科(Myricaceae)楊梅屬(Myrica)植物，果實甜酸適口，風味獨特。截至2018年，我國楊梅種植面積約33.50萬hm2，其中，浙江省栽培楊梅8.90萬hm2，產量58.44萬t，年產值50多億元，楊梅是山區農民脫貧致富的重要樹種。許多楊梅產區，尤其是海拔高于500 m的地區，經常持續低溫數天，導致楊梅樹葉片、新梢、樹干等受到嚴重凍害。楊梅適宜生長在年平均溫度15～21 ℃的地區，溫度低于-9 ℃超過48 h楊梅容易受到凍傷[1]。果園調查顯示，楊梅受凍的臨界溫度為-8～-10 ℃，幼齡樹比成年樹受凍害嚴重，遲熟品種比早熟品種受凍害嚴重[2-3]。篩選出適合高海拔地區栽培的楊梅耐凍品種是楊梅產業的迫切需求，但是目前未見楊梅抗低溫脅迫的理論研究，無法進行不同海拔和不同地區的果園品種規劃，以及低溫脅迫的預測預報和防控指導。

多種作物會受到低溫的脅迫傷害。低溫脅迫后柑橘葉片出現卷曲、失水、凍斑[4]。甘蔗植株受低溫脅迫后葉片干枯、卷曲，生長點損傷或壞死變黑，蔗莖側芽發黑、變軟，縱剖蔗莖可明顯看到莖內組織呈水煮狀[5]。開花期低溫脅迫導致水稻花粉萌發率顯著下降，穎花的不育花粉率增加[6]。低溫顯著降低大豆單株粒重[7]。烏菜受低溫脅迫后凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率均有不同程度下降[8]。

適宜的溫度是植物生存的必要條件之一，它參與調控植物的整個生長發育過程。植物在受到低溫脅迫時，多種生理生化過程與酶活性受到影響[9]。低溫顯著影響植物的細胞膜透性、活性氧保護酶活性、滲透性物質含量等，如柑橘[4]、枇杷[10]、柚木[11]、葡萄[12]、山欖科果樹[13]等在受到低溫脅迫后，相對電導率(REC)、過氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、可溶性蛋白(SP)含量和可溶性糖(SS)含量等發生顯著變化，通過隸屬函數法綜合分析細胞膜透性、活性氧保護酶活性、滲透性物質含量各生化指標能較好地評價不同品種材料的抗寒能力。低溫還影響植物的糖代謝、碳代謝和一些次級代謝等，會使淀粉和其他代謝物的降解延遲，進而影響糖酵解和其他過程，使糖代謝相關基因的表達顯著增加[14-15]；脫氫酶和金屬硫蛋白、泛素蛋白、休眠相關蛋白、質膜固有蛋白和RNA結合蛋白受低溫誘導表達[16]，產生次級代謝產物[17-18]。

本研究選擇2個生產上主栽品種東魁、荸薺種，和1個新選育早熟品種早佳，利用1年生楊梅容器苗，在人工氣候室內進行低溫脅迫條件的模擬處理，觀察不同品種植株的表型變化，研究低溫脅迫下楊梅的生理生化響應，并且采用隸屬函數法對不同楊梅品種進行抗寒性綜合評價，以期為楊梅的抗低溫育種、果園品種規劃和低溫脅迫機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為東魁、荸薺種、早佳等長勢一致的1年生盆栽楊梅嫁接苗。

1.2 處理設計

從2018年的12月至2019年的1月底進行低溫處理。每盆為1次重復，每個處理重復3次。將試驗材料全株帶盆放入海爾程控冰箱，分別進行6 ℃(對照組)、3 ℃、0 ℃、-3 ℃、-6 ℃、-9 ℃處理24 h；然后選擇成熟葉(去除主脈)迅速放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱備用，測定生理生化指標。

低溫處理后將植株移出程控冰箱，置于露天(平均溫度6 ℃)，觀察1個月，然后調查植株凍傷級數。設植株無凍害為0級，有1個枝條死亡為1級，有2～3個枝條死亡為3級，有4～5個枝條死亡為5級，有6～7個枝條死亡為7級，有8條和以上枝條死亡為9級。凍害指數(IC)(%)=各凍害級數×該級植株數/調查總植株數×100。

1.3 測定方法

參照蔡慶生[19]的方法，采用DDS-310型電導儀法測定REC。

MAD含量采用丙二醛含量測定試劑盒(MDA-2-Y)(蘇州科銘生物技術有限公司，蘇州)，按照試劑盒使用說明測定。SOD活性采用超氧化物歧化酶試劑盒(SOD-2-Y)(蘇州科銘生物技術有限公司，蘇州)，按照試劑盒使用說明進行測定。SS含量采用蒽酮比色法[20]測定。SP含量采用蘇州科銘生物技術有限公司BCA法蛋白含量測定試劑盒(BCAP-2-Y)進行測定。

1.4 抗寒性綜合評價

應用隸屬函數法[21]綜合評價3個品種的抗寒性。SOD、SP和SS采用的公式為X(μ)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)；REC和MDA采用的公式為X(μ)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)。其中，Xij為某指標的測定值，Xmax為對應指標的最大值，Xmin為對應指標的最小值，X(μ)為隸屬函數值。先根據公式分別計算出3個品種各項指標的隸屬度，然后取各項指標的算術平均值作為平均隸屬度，進行綜合排名，平均隸屬度大代表抗寒性強。

1.5 數據分析

試驗數據用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進行計算和方差分析，顯著性分析采用LSD多重比較。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對楊梅幼苗外部形態的影響

3個楊梅品種低溫受傷害的趨勢相同，輕則葉片黃化，重則出現枯斑或者葉片邊緣變紅，最后是葉片徹底干枯死亡。東魁對低溫最敏感，荸薺種和早佳相似。東魁在6 ℃處理時個別嫩葉發黃無凍傷現象，經3 ℃處理葉片開始大量發黃并出現凍傷現象，隨溫度降低發黃程度逐漸加深，葉片受凍傷越來越嚴重，低于-6 ℃處理的葉片凍傷指數達到63.0，-9 ℃處理的凍傷指數達到100.0(表1，圖1)。荸薺種在6 ℃和3 ℃處理后葉片翠綠，0 ℃處理后少許葉片開始發黃并有凍傷，隨著處理溫度的降低發黃程度逐漸加深，-9 ℃處理后完全死亡，凍傷指數達到100.0。早佳在6 ℃處理下葉片翠綠，3 ℃處理后葉片有輕微泛黃，0 ℃處理后少許葉片開始發黃有凍傷，隨著溫度的降低受凍程度逐漸加重，但-9 ℃處理后葉片殘存少許綠色，凍傷指數達到92.6。由此可見，東魁楊梅幼苗在-3 ℃處理后即受到較嚴重凍害，而荸薺種和早佳在-6 ℃處理后受到較嚴重凍害，而且是不可逆的葉片壞死。

2.2 低溫脅迫對楊梅幼苗葉片相對電導率的影響

由圖2可知，3個楊梅品種的REC隨著處理溫度降低變化趨勢不同，東魁和早佳的REC在實驗溫度內保持持續上升；而荸薺種-6 ℃處理下REC最大，隨后下降。在6 ℃至-3 ℃處理中，3個楊梅品種的REC變化趨勢一致，與6 ℃對照相比，差異不顯著。-6 ℃處理后，3個品種的REC差異顯著，與對照相比，荸薺種REC增大45.77百分點，達到峰值。東魁和早佳在-6 ℃處理下植株REC出現小幅增加，-9 ℃處理的植株REC大幅升高，與對照相比，分別增加37.4和26.88百分點。

表1 不同低溫處理后恢復培養30 d楊梅植株的凍害指數

A、B、C行分別為東魁、荸薺種、早佳品種。a、b、c、d、e、f分別為6、3、0、-3、-6、-9 ℃處理的楊梅幼苗。圖1 不同低溫處理后恢復培養30 d的楊梅植株凍害情況

這說明荸薺種經-6 ℃處理后胞內電解質外滲嚴重，而東魁和早佳經-9 ℃處理后胞內電解質外滲嚴重。

圖2 低溫脅迫對楊梅幼苗相對電導率的影響

2.3 低溫脅迫對楊梅幼苗丙二醛含量的影響

隨著處理溫度的降低，3個楊梅品種的MDA含量變化趨勢不一致，東魁和早佳呈現降—升—降的趨勢，而荸薺種則呈升—降趨勢，在整個實驗溫度范圍內荸薺種和早佳MDA含量高于東魁；6～-6 ℃處理后，荸薺種MDA含量高于早佳，早佳MDA含量高于東魁(圖3)。與6 ℃對照相比，東魁的MDA含量在3～-3 ℃處理后下降，0 ℃和-3 ℃處理后顯著降低，分別降低15.48%和23.46%；而-6 ℃和-9 ℃處理后MDA含量與6 ℃對照相比顯著升高，分別升高26.18%和15.19%。與對照相比，荸薺種的MDA含量在其他溫度處理下均有升高，其中3 ℃、0 ℃和-6 ℃處理后顯著升高，增加范圍在14.36%～38.27%，3 ℃處理的MDA含量最高。與對照相比，早佳在3、0、-3 ℃處理后MDA含量降低，3 ℃和0 ℃處理的下降顯著，分別下降12.81%、11.5%；-6 ℃和9 ℃處理的MDA含量升高，其中-6 ℃處理的MDA含量最高，與對照相比增加14.1%。這說明，荸薺種受低溫脅迫時細胞膜脂過氧化程度高，而東魁和早佳在-3 ℃及以上溫度時膜脂過氧化程度輕，產生較少的MDA。

圖中數據以鮮重計。圖4～6同。圖3 低溫脅迫對楊梅幼苗丙二醛含量的影響

2.4 低溫脅迫對楊梅幼苗抗氧化酶活性的影響

隨著處理溫度的降低，3個楊梅品種的SOD活性變化趨勢不同，東魁呈升—降—升趨勢，荸薺種呈降—升—降趨勢，早佳總體保持下降趨勢。整個試驗溫度內，早佳SOD活性均高于荸薺種；除-9 ℃處理外，早佳的SOD活性也均高于東魁(圖4)。6 ℃對照組中，3個品種SOD活性差異顯著，其中早佳SOD活性最高，顯著高于荸薺種和東魁；荸薺種次之，東魁最低。東魁各處理組的SOD活性均比對照顯著增加，比對照高出13.16%～37.6%，-3 ℃處理的SOD活性最大。荸薺種的SOD活性只有-6 ℃處理的植株比對照高10%，其他溫度處理的SOD活性均比對照低，其中0 ℃、-3 ℃和-9 ℃處理比對照顯著降低，低23%～34%。與對照相比，0 ℃和3 ℃處理的早佳植株SOD活性沒有顯著變化，-3 ℃時開始下降，-9 ℃處理的SOD活性最小。這說明早佳品種的SOD活性強于東魁和荸薺種，東魁品種SOD活性在低溫脅迫下增強；而荸薺種SOD活性在低溫脅迫下降低，受低溫脅迫影響較大。

圖4 低溫脅迫對楊梅幼苗SOD活性的影響

2.5 低溫脅迫對楊梅幼苗有機溶質質量分數的影響

隨著處理溫度降低，3個品種楊梅幼苗的SP含量變化趨勢不一致，東魁和荸薺種呈升—降—升—降”趨勢，早佳呈升—降—升—降—升趨勢，且三者的峰值均不同(圖5)。整個試驗溫度范圍內荸薺種的SP含量始終高于東魁；6 ℃、3 ℃和-3 ℃處理的早佳植株SP含量高于東魁和荸薺種。經-6 ℃～3 ℃處理的東魁SP含量均顯著高于對照，高11.56%～34.21%；-9 ℃處理的植株與對照無顯著差異。在所有處理組中，荸薺種的SP含量均顯著高于對照，高15.62%～57.73%，且0 ℃處理的植株SP含量最高。經3 ℃、0 ℃和-3 ℃處理的早佳植株SP含量高于對照，其中，-3 ℃和3 ℃處理的SP含量分別比對照組高42.63%和33.63%；-9 ℃和-6 ℃處理的SP含量顯著低于對照，分別比對照組低15.61%和26.49%。這說明荸薺種的SP保護能力持續高于東魁，6 ℃、3 ℃、-3 ℃處理的早佳植株SP的保護能力強于東魁和荸薺種。

圖5 低溫脅迫對楊梅幼苗可溶性蛋白含量的影響

低溫處理后3個品種楊梅幼苗的SS含量變化趨勢基本一致，呈現先升后降趨勢，但是出現峰值的時間和變化幅度不一樣(圖6)。東魁幼苗在3 ℃處理后SS含量出現最高，比對照組高12.8百分點，其他處理組與對照沒有顯著差異。荸薺種在0 ℃處理后植株SS含量最大，0 ℃和3 ℃處理SS含量顯著高于對照，分別高16.57百分點和10.53百分點；溫度低于-3 ℃后，各處理的SS含量與對照無顯著差異。3、0、-3 ℃處理的早佳SS含量與對照差異不顯著，而經-6 ℃和-9 ℃處理的SS含量顯著低于對照，分別低17.94和9.10百分點。

圖6 低溫脅迫對楊梅幼苗可溶性糖含量的影響

2.6 楊梅幼苗抗寒性綜合評價

應用隸屬函數法對楊梅抗寒性生理指標進行綜合分析，其中REC、MDA的隸屬函數值由反隸屬函數公式求得。東魁、荸薺種、早佳的平均隸屬度為0.482、0.520、0.576。由表2可知，不同品種抗寒性強弱順序為早佳>荸薺種>東魁。該結果與楊梅低溫脅迫的表型數據相吻合，說明隸屬函數法能客觀評價不同楊梅品種的抗寒性。

表2 低溫脅迫下3個品種楊梅各指標隸屬函數值與抗寒性綜合評價

3 小結與討論

低溫脅迫是重要的非生物脅迫之一，影響植物的生長、繁育、產量、質量與地理分布等。前人研究發現，低溫脅迫對植株表型有很大影響，植物受損的直接表現有萎蔫、葉片呈水漬狀、果實出現斑點、苗木變弱、生長遲緩、黃化、產量下降、品質降低和局部組織壞死等[22]。本文研究發現，楊梅幼苗受低溫脅迫后，癥狀較輕時葉片黃化，稍微嚴重時葉片出現枯斑或者葉片邊緣變紅，嚴重時葉片徹底干枯死亡，與前人報道一致。

低溫損害后植物體內不斷積累活性氧自由基，引起膜脂過氧化。MDA是膜脂過氧化作用的主要產物之一，導致質膜透性增大，胞內電解質外滲，引起相對電導率升高，REC的高低和MDA含量表明了細胞膜受損傷的程度，與耐寒性呈負相關；SOD和過氧化氫酶(CAT)等可消除活性氧自由基，減輕植物受到的氧化脅迫損害，與耐寒性呈正相關；SP和SS降低了滲透勢，減緩因低溫導致的細胞失水，一定程度上減輕了植物的低溫傷害，與抗寒性綜合評價呈正相關[11,22-25]。東魁和早佳楊梅的REC隨著溫度降低保持持續上升趨勢，這與其他植物相似[23,25]，但是荸薺種卻是先升后降，與前人報道不同。這說明不同楊梅品種在受低溫傷害臨界值時胞內電解質外滲不但受低溫影響，還受自身生理生化等其他因素的影響。

單一抗寒指標不足以判斷植物對逆境的適應能力，采用隸屬函數法進行綜合評價結果更為可靠[4-5,26]。在0 ℃、-2 ℃和-4 ℃處理24 h，隨著處理溫度降低，不同柑橘品種的MDA含量均呈現顯著降低趨勢，SS含量呈先升高后降低趨勢[4]。在0～-25 ℃低溫下脅迫2 h，6種木蘭科植物葉片SP含量和SOD活性呈先升高后降低的趨勢[26]。-12～-27 ℃低溫處理葡萄1年生枝條24 h，隨著處理溫度下降，所有處理葡萄枝條SS含量先上升后下降，SOD活性呈升高—降低—升高—降低的趨勢[12]。3～-5 ℃低溫處理24 h，隨處理溫度降低，各品種枇杷幼果種胚REC呈現小—大—小的S型變化曲線，6個枇杷品種的MDA含量隨低溫脅迫均呈現出先升高后降低的倒V型變化趨勢[10]。3個楊梅品種的MDA含量、SOD活性、SP和SS含量變化趨勢表現較為復雜，與木蘭、葡萄、枇杷和西番蓮等個別指標類似。這些植物不同生理生化指標的趨勢差異很可能是因為植物本身對溫度的敏感性不同，涉及低溫脅迫溫度不同引起的。在3～-3 ℃處理下，早佳和東魁的SOD活性較強，清除活性氧免受傷害的能力強于荸薺種，-3 ℃及以上溫度處理時膜脂過氧化程度輕，產生較少的MDA，胞內電解質外滲少，這說明SOD活性對早佳和東魁的抗寒性很重要，但是荸薺種可能有其他作用更強的活性氧清除酶。荸薺種SP的保護能力持續高于東魁，這說明SP對荸薺種的抗寒性有較為重要的作用。當溫度低于-3 ℃時，3個楊梅品種的SS含量都較低，這說明溫度過低SS失去了對楊梅的保護作用。采用REC、MDA、SOD、SP和SS的隸屬函數法評價3個楊梅的抗寒性結果與表型結果一致，因此，這5個指標可以作為楊梅抗寒性評價的關鍵指標。

噴施一些抗凍物質可以調控植物受到低溫脅迫后的生理生化反應，提高植物的抗寒性，如EBR(24-表油菜素內酯)[27]、防凍劑[28]、生物刺激素PVE (paecilomyces variotiiextracts)[29]、外源一氧化氮(NO)供體硝普鈉(SNP)[30-31]和ABA[32]等。當環境溫度低于3 ℃時，建議及時給楊梅噴施抗凍物質，可能會有效減輕楊梅尤其是高山楊梅受到的低溫傷害。目前已有報道一些基因與功能蛋白參與植物的低溫脅迫[33-35]，但是研究尚不夠深入。今后應挖掘誘導楊梅冷馴化和耐寒能力的關鍵基因，尤其是SS代謝相關的基因，利用現代生物技術手段，有目的地提高楊梅的抗寒性，為耐寒性強楊梅種質資源的良種選育與新品種創制提供基礎，擴大楊梅的栽培范圍。

本文研究結果說明楊梅的抗寒機制十分復雜，不能采用單一生理生化指標進行抗寒性評價，隸屬函數法評價的抗寒性與低溫受害表型一致，說明REC、MDA、SOD、SP和SS可以作為綜合評價楊梅抗寒性的關鍵指標。本研究填補了楊梅抗寒性理論研究的空白，不足之處是未就參與低溫脅迫的關鍵基因和功能蛋白進行研究，未就增強楊梅抗凍性的物質進行篩選。