桃細菌性穿孔病病原鑒定

趙文靜，紀兆林，葛金濤，繆美華，劉興滿*

(1.連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222000； 2.揚州大學，江蘇 揚州 225000)

桃樹在我國已有3000年的栽培歷史，在《齊民要術》上就有關于桃樹生長特性、繁殖特點、栽培技術的詳盡記載[1-2]。隨著科技的發展，人們在栽培和管理桃樹方面有了長足的進步。

桃樹是連云港市栽培數量較多的一種果樹，根據連云港市自然資源與規劃局的統計，在2018年連云港地區桃園面積達5 000 hm2左右。隨著果園管理的日益規范和對桃樹種植經濟價值的追求，果農們對桃樹上出現的病害也越發關注。近幾年，連云港地區桃細菌性穿孔病的爆發日益頻繁，嚴重為害了桃樹葉片和果實，給果農造成巨大的經濟損失。

本研究采集了連云港市桃園中出現的桃穿孔病病樣，采用形態特征和 16S-23SrDNAITS分子鑒定方法進行病原鑒定。病原菌研究結果表明，引起連云港地區桃細菌性穿孔病的病原為樹生黃單胞菌李致病變種Xanthomonasarboricolapv.pruni(Xap)(異名：Xanthomonascampestrispv.pruni，Xanthomonaspruni)，本研究旨在為連云港市的桃細菌性穿孔病的預防和病原鑒定提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病害樣本采集

2019年7月于連云港班莊鎮桃樹種植園中采集具有典型病害癥狀的桃樹穿孔病葉，記錄其為害癥狀特點。

1.2 病原菌的分離、純化與保存

采用組織分離法進行病原菌分離[3]。首先用清水將病樣表面沖洗干凈、晾干，然后用刀片取病葉病健交界處組織數塊2 mm見方，接著將病樣組織浸漬于0.5%的次氯酸鈉溶液消毒1 min，再用無菌水沖洗2～3次，隨后浸漬在少量無菌水里，用滅菌玻棒搗爛，使組織內細菌溢出。最后用接菌環蘸取菌液在NA平板劃線后將平板倒置于28 ℃培養箱中培養，待菌落長出后，用接菌環挑取單菌落進行劃線純化，如此重復純化3～4次。

取純化后新鮮的單菌落于NB試管中，于180 r·min-1、28 ℃過夜搖菌，取1 mL菌液離心去上清，然后沉淀加入200 μL 20%的甘油混勻，-80 ℃保存。

1.3 病菌種類鑒定

1.3.1 形態特征觀察

觀察分離菌株在NA平板上的菌落形態、顏色及色素產生等情況，并拍照記錄菌落形態特征。

1.3.2 分子生物學鑒定

DNA提取。將保存的菌株在NA平板上活化，蘸取新生長的單菌落于NB試管中，于180 r·min-1、28 ℃下過夜搖菌，之后參照生工生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌的DNA，并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測gDNA的質量，于-20 ℃下保存。

16S-23S ITS序列擴增。以病原菌的gDNA為模板，采用細菌通用引物16S-23S ITS序列進行PCR擴增，引物序列如下：ITS-f：5′-AGTCGTAACAAC GTAGCCGT-3′；ITS-r：5′-GTGCCAAGGCATCCAC C-3′。采用50 μL PCR擴增體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ITS-f/ITS-r(10 μM)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 10 min，并于4 ℃終止反應。取6 μL擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格后送往公司測序。將測序病原菌rDNA-16S-23S ITS的序列在Gen-Bank數據庫中進行BLAST比對，篩選與分離菌株相似度較高的同源DNA序列。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

桃細菌性穿孔病主要為害桃樹的葉片和果實。在病害初期主要是在侵染葉片，先在葉片上形成水漬狀斑點，隨后病部組織逐漸壞死形成褐色病斑，病斑慢慢干枯脫落，形成葉片穿孔癥狀，病情嚴重時病斑接連成片，造成葉片大量脫落，引起樹勢衰弱(圖1)。同時，桃細菌性穿孔病菌也會在桃果實上形成病斑，初時為淡褐色水漬狀小圓斑且病斑邊緣有黃綠色暈圈，隨后病斑逐漸擴大，嚴重時病斑接連，造成果實凹裂，天氣潮濕時，還易產生含菌膿的黏質分泌物等，造成果樹極大的減產。

圖1 桃細菌性穿孔病病葉

2.2 病原菌形態

將保存的病原菌純化2～3次后，觀察到菌體菌落呈淡黃色、濕潤、黏稠、飽滿的狀態(圖2)。

圖2 桃細菌性穿孔病菌純化后形態

2.3 病原菌16S-23S ITS序列分析

本研究以3個分離菌DNA為模板，采用細菌通用引物16S-23S ITS序列對這3個分離菌株L-1、L-2和L-3進行PCR擴增，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得3條600 bp大小的清晰條帶(圖3)。將擴增產物送公司測序，通過測序結果和BLAST同源比對分析發現，3株分離株的16S-23S rDNA ITS序列與Xanthomonasarboricolapv.pruni相似性最高，達95%以上，從而初步支持這3株分離菌株為樹生黃單胞菌李致病變種(Xanthomonasarboricolapv.pruni)。

圖3 基于16S-23S rDNA ITS序列部分菌株擴增凝膠電泳

3 小結與討論

通過病害形態觀察和分子生物學方法，觀察病害的病部癥狀、菌株形態，同時比對分析分離株的擴增產物發現，分離株與Xanthomonasarboricolapv.pruni相似性最高，初步鑒定為Xanthomonasarboricolapv.pruni。

通過對致病菌Xanthomonasarboricolapv.pruni的文獻檢索發現，早在1903年北美就首次報道了該病原能夠侵染日本李子[4]；70年代中期，意大利東北部爆發桃細菌性穿孔病，造成嚴重的經濟損失[5]；2014年阿拉貢地區同樣爆發該病害，造成杏仁的大減產[6]。之后在日本、法國、德國、俄羅斯、西班牙、瑞士等國家也陸續有該病原的報道[7]。由于該病害給果園帶來巨大減產，造成嚴重的經濟損失，歐盟和EPPO等地區已決定將Xap列為檢疫性病原物[8-10]。

通過觀察該病害的發生與流行發現，該病害一般在5月初就出現癥狀，在高溫多雨的6—8月病情較重，即病情的發生嚴重程度可能與降雨量、濕度、溫度都有一定的相關性。為有效地防控桃細菌性穿孔病，將在其生物學特性、發生規律、傳播途徑和防控技術等方面做進一步研究。