3D打印羥基磷灰石-明膠支架聯合BMSCs和HUVECs修復兔顱骨缺損的組織學評價*

王宏，范海霞，Tai-Hsien Wu，Ching-chang Ko，耿海霞

（1.濰坊醫學院 口腔醫學院，山東 濰坊 261053；2.濟寧醫學院 口腔醫學院，山東 濟寧272000；3.俄亥俄州立大學牙科學院 正畸學部，俄亥俄州 哥倫布 43210）

骨組織工程為骨缺損修復提供了新的方向。由于材料的不斷改進，學者們對于骨替代材料的研究與構建，已從單一類型的支架材料逐漸過渡至復合型支架材料[1-2]。其中羥基磷灰石（Hydroxyapatite, HAP）和明膠（Gelatin, GEL）構成的復合型支架材料在組織工程學研究中具有很大優勢，目前已成為骨組織再生領域中的研究熱點[3]。研究表明，這種支架成分與天然骨組織中磷灰石礦物組成極為相似，具有仿生特性，且支架的機械、生物學性能好、骨傳導性和骨結合能力強，在骨修復方面具有明顯的優勢[4-5]。近年來，隨著3D 打印技術的發展，精確打印的三維多孔支架在骨組織工程領域得到廣泛應用，成為頜面部骨缺損治療的熱點和新突破點[6-7]。骨髓間充質干細胞（BMSCs）與臍靜脈內皮細胞（HUVECs）是骨組織工程常用的種子細胞，有研究顯示，將BMSCs 和HUVECs 種子細胞共培養，其成骨和成血管潛能較單獨培養時提高[8]，可能為骨組織工程和骨再生提供一個很有前景的方法。

本實驗根據前期實驗[9]，制備出3D 打印HAPGEL 支架，負載BMSCs 和HUVECs 種子細胞后用于兔顱骨缺損修復，通過組織學觀察其在臨界大小骨缺損中的成骨修復效果，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物選用健康普通級、8 周齡、雄性新西蘭大白兔24 只，動物許可證號：SCXK（魯）20150001，體重1.5 ～2.0 kg，由濟南西嶺養殖繁育中心提供。

1.1.2 種子細胞BMSCs 和HUVECs 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.3 HAP-GEL 支架材料HAP-GEL 支架由納米級羥基磷灰石和明膠經3D 打印制備而成，直徑8 mm，厚度2 mm，呈圓形片狀，由美國北卡羅萊納大學牙學院研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

細胞培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司），水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司），慶大霉素（濟寧辰欣藥業股份有限公司），石蠟切片機（型號RM2235，德國萊卡公司），烘箱（型號Heratherm OMS60，美國Thermo Fisher Scientific 公司），蘇木精-伊紅染色試劑盒（北京索萊寶生物有限公司），Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），正置顯微鏡（型號E200，日本Nikon 公司）。

1.3 方法

1.3.1 復合體構建將EO 滅菌后的HAP-GEL 支架材料浸沒于DMEM 培養基，并于恒溫細胞培養箱（37℃，5%二氧化碳）內孵育24 h。共培養BMSCs 和HUVECs細胞并制成細胞懸液，HAP-GEL 支架浸泡于細胞懸液中，負壓抽吸，靜置于細胞培養箱中3 d，使種子細胞充分黏附。

1.3.2 動物模型的復制及分組新西蘭大白兔稱重后，用10%水合氯醛按3 ml/kg 行腹腔注射麻醉，待麻醉完畢后，將其俯臥位妥善固定于手術臺，頭部備皮，縱行切開顱頂部皮膚，仔細剝離骨膜，暴露顱骨。用環切刀在顱骨矢狀縫左側，慢速全層切除直徑為0.8 cm 的圓形骨缺損，術中輔以滴水降溫。將24 只新西蘭大白兔編號后，隨機分為空白對照組、陽性對照組、HAP-GEL 材料組及BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培養組，每組6 只。空白對照組留置空白缺損；陽性對照組在骨缺損處隨機植入自體顱骨；HAP-GEL 材料組在骨缺損處隨機植入HAP-GEL 支架；BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培養組在骨缺損處隨機植入HAP-GEL 支架與BMSCs 和HUVECs細胞復合體。術區組織分層對位縫合，術后肌內注射慶大霉素4 萬u/d，1 次/d，共3 d。

1.3.3 組織學觀察分別于術后4 周和12 周處死新西蘭大白兔，于組織工程骨成骨區外3 mm 取材，4%多聚甲醛固定48 h，10% EDTA 溶液常溫下脫鈣處理，脫鈣液更換頻率為1 次/3 d，期間用大頭針輕戳標本，至針頭可輕松刺入標本提示脫鈣完成。標本流水沖洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，制成厚度為4μm 的組織切片，行HE 染色及Masson 染色，在光學顯微鏡下觀察各組材料與組織相容性、新生骨組織和骨質成熟情況。

2 結果

2.1 大體觀察

術后7 d 切口達到一期愈合。術后新西蘭大白兔無死亡，術區無感染，飲食、活動正常。

2.2 HE 染色

各組均未見明顯炎癥細胞浸潤。術后4 周，空白對照組骨缺損區內僅有少量纖維結締組織生成，呈網格狀，稀疏排列（見圖1A）；HAP-GEL 材料組有少量新骨生成，呈島狀散在分布于纖維結締組織及不規則骨小梁中（見圖1B）；BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培養組可見部分新骨開始彼此融合（見圖1C），新生骨量與陽性對照組相似（見圖1D）。術后12 周，空白對照組可見缺損區內僅有小面積骨島形成（見圖2A）；HAP-GEL 材料組新骨相互融合，呈較大面積的板層狀（見圖2B）；BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培養組新生骨量較前兩組明顯增多，缺損區幾乎全部被新骨充填（見圖2C）；陽性對照組新骨形成量與BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培養組相似（見圖2D）。

圖1 術后4 周各組骨缺損處的組織學觀察 （HE 染色×100）

圖2 術后12 周各組骨缺損處的組織學觀察 （HE 染色×100）

2.3 Masson 染色

術后4 周，空白對照組僅存在少量纖維組織充填于骨缺損區（見圖3A）；HAP-GEL 材料組內有藍染的新生骨形成，并已出現少量夾雜藍染新骨的紅染成熟骨，但著色均較淺（見圖3B）；BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培養組可見深染藍色新骨包繞支架，且紅染成熟骨面積較HAP-GEL 材料組大（見圖3C），修復效果與陽性對照組相似（見圖3D）。術后12 周，空白對照組內有藍染新生骨組織生成（見圖4A）；HAP-GEL 材料組成熟骨面積進一步擴大，支架被分割包裹、吸收（見圖4B）；BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培養組可見大片紅染成熟骨，其間夾雜少量藍染新生骨，支架僅殘存少量（見圖4C），成骨效果與陽性對照組相似（見圖4D）。

圖3 術后4 周各組骨缺損處的組織學觀察 （Masson 染色×100）

圖4 術后12 周各組骨缺損處的組織學觀察 （Masson 染色×100）

3 討論

種子細胞是骨組織工程骨研究的基礎。其中BMSCs 因來源豐富、具有較強的體外增殖能力和成骨分化潛能，已成為公認的較為理想的種子細胞[10-12]。而HUVECs 也因可產生多種因子，以及不涉及安全性和倫理學等問題，成為組織工程學研究中應用較為廣泛的種子細胞之一。研究證實，將上述2 種細胞共培養，具有相互協同的作用。加入HUVECs 后，可促進BMSCs中I 型膠原和堿性磷酸酶的表達上調；HUVECs 也可通過調控轉錄因子Dlx5、Cbfa1/Runx2、Osterix 的表達，增強BMSCs 的成骨能力，從而構建有利于骨生長及骨重建的局部微生態環境[13-16]。在本實驗中，筆者通過Masson 染色證實，BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培養組可見明顯的藍染新骨在支架材料周圍聚集形成，術后12 周，還可見大量的成熟骨連接成片，成骨效果和陽性對照組接近。HE 染色結果也驗證了上述發現。上述結果表明，HUVECs 和BMSCs 可能通過分泌某些細胞因子、轉錄因子，加速骨缺損的修復過程。

支架材料是組織工程骨的重要組成部分，理想的支架材料應具備與天然骨組織相似的性能，以模擬其修復效果[17]。HAP 是一種天然的磷灰石礦物，參與構成骨組織中50%～70%的礦物質成分[18]，其憑借自身優越的生物相容性、骨誘導性及低免疫原性，成為目前應用最多的生物材料[19]。普通HAP 粒徑較大，生物降解性較差，韌性不佳；但納米級HAP 具有更好的表面效應，生物活性與降解性亦優于普通HAP[20-21]。GEL 具有良好的生物學性能，易于降解，且結構中含大量親水基團，可支持種子細胞的種植；此外GEL含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽序列，能夠增加細胞的識別位點，促進種子細胞在支架上黏附、生長[22-24]。但GEL 力學性能較差，嚴重影響了其在臨床上的進一步應用[25]。研究表明，納米級HAP 與GEL復合支架，能夠模擬天然骨的成分與微結構特征，具有與周圍骨組織鍵合的能力[26-27]；同時GEL 可提高支架的降解速率；HAP 能夠改善支架的機械和生物性能，實現兩者優勢互補[28]。本課題組前期研究制備合成HAP-GEL 支架，復合成骨細胞后用于兔顱骨缺損的修復，發現其具有一定誘導骨生成的作用[9]。而本實驗中采用的3D 打印HAP-GEL 支架具有以下優勢：①支架采用3D 打印，能夠更好地與骨缺損區匹配；②術后切口處愈合良好，無明顯排異反應；組織學觀察也未見明顯的炎癥細胞浸潤，說明3D 打印HAPGEL 支架具有良好的生物相容性；③支架結構為種子細胞BMSCs 和HUVECs 的黏附、生長及相互作用提供了一種生理性的優化環境。HE 和Masson 染色結果證實，與空白對照組相比，HAP-GEL 材料組，可明顯促進新生骨的形成，而BMSCs+HUVECs+HAP-GEL支架共培養組成骨效果與自體移植骨類似。這表明，3D 打印HAP-GEL 支架材料具有良好的成骨效果。

綜上所述，本實驗所采用的3D 打印HAP-GEL支架材料具有良好的骨誘導作用，且在種子細胞BMSCs 和HUVECs 的作用下，可更好地修復顱骨缺損，為臨床應用提供理論依據。本實驗僅對3D 打印HAP-GEL 支架材料復合種子細胞對顱骨的修復效果進行了組織學層面的分析，其具體的修復機制還需要進一步深入研究。