依達拉奉對氧誘導視網膜病變乳鼠的作用及其機制研究*

姚東偉，田川，胡東瑞，曹瑾，楊路，張萍

（1.寧波市第一醫院 眼科，浙江 寧波315012；2.寧波大學醫學院附屬醫院 眼科，浙江 寧波 315000）

早產兒視網膜病變是一種復雜的多因素疾病，主要病理特征為早期視網膜血管閉塞導致大量異常新生血管形成，容易發生出血、滲出等，嚴重者可引起視網膜脫離，視力喪失[1]。隨著醫療水平的提高，越來越多的早產兒得到成功救治，新生兒存活率顯著提高，但早產兒視網膜病變發病人數卻隨之增加。早產兒視網膜病變發病機制復雜，其中給氧治療與早產兒視網膜病變關系密切。研究發現，吸氧過程中存在氧自由基損傷，其在早產兒視網膜病變發病機制中發揮重要作用[2]。高氧可誘導未發育成熟的視網膜血管收縮，甚至閉塞，視網膜組織氧含量相對降低，引起一些血管生長因子分泌，促進新生血管形成，從而誘導早產兒視網膜病變[3]。依達拉奉為神經保護藥物，同時也是一種強效的抗氧化劑，具有較強的氧自由基清除能力，可以保護組織免受氧化應激損傷[4-5]，如依達拉奉可通過清除氧自由基減輕阿爾茨海默病患者的神經損傷[6]，提高急性腦梗死的治療效果[7]。依達拉奉對糖尿病視網膜病變中具有保護作用，可通過提高抗氧化成分活性，加速自由基清除，減輕視網膜氧化應激損傷，從而發揮對視網膜的保護作用[8]，但其在早產兒視網膜病變中的作用尚不清楚。本文通過復制早產兒視網膜病變動物模型，研究依達拉奉對氧誘導視網膜病變乳鼠的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級、7日齡C57BL/6 乳鼠購自上海斯萊克有限公司，動物許可證號：SCXK（蘇）2018-0003。將60 只乳鼠根據隨機數字表法分為正常對照組、高氧誘導組和藥物治療組，每組20 只。

1.2 主要試劑和儀器

依達拉奉（淮南市國藥集團國瑞藥業，批號1709134），伊紅、蘇木精（美國Sigma 公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活力檢測試劑盒和丙二醛（malondialdehyde, MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）酶（上海生工生物工程股份有限公司），兔抗鼠血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）單克隆抗體和兔抗鼠CD34 單克隆抗體（美國Abcam 公司），DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），BX43 型顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.3 動物模型的復制

高氧誘導組和藥物治療組乳鼠在高氧倉（自制）中生活5 d（出生第7 ～11 天），期間由原母鼠和1 只替換母鼠間隔12 h 交替哺乳。高氧倉氧流量控制在1.5 L/min，使倉內氧濃度在75%左右，溫度控制在21℃左右，氧分壓為常壓，采用測氧儀測定倉內氧濃度4 ～6 次/d；每天定時進行加食、換水、更換墊料。正常對照組乳鼠在正常空氣中飼養。5 d 后（出生第12 天起），將高氧誘導組和藥物治療組乳鼠從高氧倉中取出，放到正常空氣中飼養。藥物治療組給予依達拉奉3 mg/kg，用生理鹽水稀釋后靜脈注射；高氧誘導組和正常對照組乳鼠給予等量生理鹽水靜脈注射。用藥至出生第16 天，每天測量乳鼠體重，出生第17 天進行取材檢測。

1.4 取材

各組選10 只乳鼠，取出其右眼球，4%甲醛固定，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色；取左眼球，剝離視網膜，用于生化檢測。各組取5 只乳鼠，取眼球，4%甲醛固定，用于ADP 酶染色；取各組剩余5 只乳鼠視網膜用于檢測VEGF 表達。

1.5 視網膜SOD 活力和MDA 含量檢測

將乳鼠視網膜組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用黃嘌呤法測定視網膜SOD 活力和MDA 含量。

1.6 視網膜HE 染色

將各組乳鼠視網膜組織用甲醛固定3 ～5 d，梯度酒精脫水，二甲苯透明，經浸蠟、石蠟包埋，切成4μm 厚切片，烤片6 ～12 h。梯度酒精脫蠟復水，切片蘇木精染色5 min，自來水返藍，再伊紅染色3 ～5 min，自來水沖洗，經脫水、透明、封固。顯微鏡下觀察，細胞漿呈粉紅色，細胞核呈藍色。

1.7 視網膜ADP 染色

將各組乳鼠視網膜用0.05 mol/L Tris-順丁烯二酸緩沖液沖洗。配置反應液：0.2 mol/L Tris-順丁烯二酸緩沖液+硝酸鉛3.0 mmol/L+氯化鎂6.0 mmol/L+ADP 粉末1 g/L。將視網膜置入配置的反應液中孵育15 min，Tris-順丁烯二酸緩沖液沖洗，加入1 ∶10 稀釋的硫化銨染色5 min，可見棕色沉淀，Tris-順丁烯二酸緩沖液沖洗，50%甘油-PBS 封片，顯微鏡下觀察并拍照。采用Image-ProPlus 測量高氧誘導組和藥物治療組乳鼠視網膜無灌注區面積。

1.8 免疫組織化學染色檢測視網膜中VEGF、CD34 的表達

將視網膜石蠟包塊經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，過氧化氫孵育15 min，阻斷、滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液水煮10 min 修復抗原，加入一抗（兔抗鼠VEGF 單克隆抗體、兔抗鼠CD34 單克隆抗體），過夜孵育，加入二抗孵育30 min，DAB 染色，自來水沖洗，蘇木精復染，經干燥、封片、拍照觀察。采用Image-ProPlus 測定各組視網膜組織中VEGF、CD34 的累積光密度值和平均光密度值。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組乳鼠體重變化

3 組乳鼠出生后12 d、13 d、14 d、15 d 和16 d的體重比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的乳鼠體重有差別（F=19.055，P=0.000）；②3組乳鼠體重有差別（F=31.229，P=0.000）；③各組乳鼠體重變化趨勢有差別（F=3.688，P=0.000）。見表1。

表1 各組乳鼠不同時間點的體重比較 （n =20，g，±s）

表1 各組乳鼠不同時間點的體重比較 （n =20，g，±s）

組別 12 d 13 d 14 d 15 d 16 d正常對照組 5.08±1.19 5.42±1.29 5.70±1.30 5.82±1.43 5.79±1.42高氧誘導組 4.39±0.37 4.50±0.38 4.53±0.39 4.52±0.41 4.63±0.38藥物治療組 4.26±0.48 4.64±0.53 4.85±0.52 5.19±0.57 5.44±0.59

2.2 各組乳鼠視網膜SOD 活力和MDA 含量比較

各組乳鼠視網膜SOD 活力和MDA 含量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，高氧誘導組SOD 活力降低（P＜0.05），MDA 含量升高（P＜0.05）；與高氧誘導組比較，藥物治療組SOD活力升高（P＜0.05），MDA 含量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組乳鼠視網膜SOD 活力和MDA 含量比較（n =10，±s）

表2 各組乳鼠視網膜SOD 活力和MDA 含量比較（n =10，±s）

注：①與正常對照組比較，P ＜0.05；②與高氧誘導組比較，P ＜0.05

組別 SOD/（u/mg） MDA/（nmol/mg）正常對照組 22.564±3.323 9.882±1.361高氧誘導組 18.358±1.367① 15.507±1.785①藥物治療組 21.280±2.120② 10.383±1.086②F 值 8.005 46.761 P 值 0.002 0.000

2.3 各組乳鼠視網膜HE 染色結果

正常對照組乳鼠視網膜結構清晰、層次分明，未見病變；高氧誘導組乳鼠視網膜節細胞層疏松水腫，節細胞層和內網層內及內界膜外層見大量血管增生并伴管腔擴張，節細胞層和內網層見出血；藥物治療組節細胞層和內網層未見出血，余病變同高氧誘導組。見圖1。

2.4 各組乳鼠視網膜ADP 染色結果

正常對照組乳鼠視網膜無明顯深棕色沉淀，高氧誘導組乳鼠視網膜深棕色沉淀明顯，藥物治療組視網膜深棕色沉淀較高氧誘導組減輕（見圖2）。藥物治療組、高氧誘導組視網膜ADP 染色無灌注區面積分別為（2.62±0.55）×106μm2和（3.94±1.11）×106μm2，經t檢驗，差異有統計學意義（t=2.377，P=0.045），藥物治療組小于高氧誘導組。

圖1 各組乳鼠視網膜 （HE 染色×400）

圖2 各組乳鼠視網膜 （ADP 染色）

2.5 各組乳鼠視網膜VEGF 的表達

各組乳鼠視網膜VEGF 累積光密度值和平均光密度值比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，高氧誘導組視網膜VEGF 累積光密度值和平均光密度值升高（P＜0.05）；與高氧誘導組比較，藥物治療組視網膜VEGF 累積光密度值和平均光密度值降低（P＜0.05）。見表3 和圖3。

表3 各組乳鼠視網膜VEGF 光密度值比較 （n =5，±s）

表3 各組乳鼠視網膜VEGF 光密度值比較 （n =5，±s）

注：①與正常對照組比較，P ＜0.05；②與高氧誘導組比較，P ＜0.05。

組別 累積光密度值 平均光密度值正常對照組 11 566.4±3 609.0 0.17535±0.02903高氧誘導組 20 652.8±4 086.5① 0.24536±0.03000①藥物治療組 14 233.2±1 557.4② 0.18555±0.02402②F 值 10.178 9.249 P 值 0.003 0.004

圖3 各組乳鼠視網膜VEGF 的表達 （免疫組織化學染色×200）

2.6 各組乳鼠視網膜CD34 的表達

各組乳鼠視網膜CD34 累積光密度值和平均光密度值比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，高氧誘導組視網膜CD34 累積光密度值和平均光密度值升高（P＜0.05）；與高氧誘導組比較，藥物治療組視網膜CD34 累積光密度值和平均光密度值降低（P＜0.05）。見表4和圖4。

表4 各組乳鼠視網膜CD34 光密度值比較 （n =5，±s）

表4 各組乳鼠視網膜CD34 光密度值比較 （n =5，±s）

注：①與正常對照組比較，P ＜0.05；②與高氧誘導組比較，P ＜0.05。

組別 累積光密度值 平均光密度值正常對照組 175 745±63 992 0.6501±0.03623高氧誘導組 319 119±105 148① 0.6999±0.01349①藥物治療組 80 470±69 778② 0.6024±0.05599②F 值 9.582 7.711 P 值 0.004 0.007

圖4 各組乳鼠視網膜CD34 的表達 （免疫組織化學染色×400）

3 討論

早產兒視網膜病變是低出生體重兒和早產兒視網膜毛細血管發育異常導致的一種視網膜病變，嚴重者可致盲。早產兒視網膜病變主要表現為視網膜新生血管增生、神經細胞發生凋亡，導致視網膜及視功能損害。新生血管形成涉及多種細胞因子，包括促血管生成因子和抑制血管生成因子，其中VEGF 在正常視網膜血管生成和早產兒視網膜病變發病中發揮重要作用[9]。

給氧是發生早產兒視網膜病變的主要因素，給氧可導致氧自由基增多，過多的氧自由基可引起視網膜損傷[10]。SOD 在生物體各種組織中廣泛存在，為氧自由基清除劑，是重要的抗氧化酶[11]。MDA 為自由基作用于脂質、發生過氧化反應的中間產物，可引起蛋白質、核酸等生物大分子發生聚合，具有細胞毒性[12]。SOD 活力降低、MDA 含量升高表明氧化應激程度增加。VEGF 為主要促血管形成因子，在新生血管形成中發揮促進作用，其水平升高可反映新生血管形成增加[13-14]。ADP 染色深棕色沉淀增加也反映新生血管形成增加[15]。CD34 抗原主要在造血干細胞和血管內皮細胞中表達，是一種跨膜細胞糖蛋白，可用于標記新生血管。在視網膜新生血管中，CD34 陽性表達。視網膜中CD34 陽性表達增加，表明血管新生增加[16]。結合本研究結果分析高氧可誘導乳鼠視網膜病變，高氧可導致視網膜氧自由基增加，過多的氧自由基引起視網膜VEGF 和CD34 表達水平升高，VEGF 和CD34的高表達表明高氧誘導可促進新生血管形成，從而誘發早產兒視網膜病變。

目前早產兒視網膜病變的主要治療手段包括冷凝、激光光凝、抗VEGF 等，冷凝和激光治療雖然有一定療效，但是對視網膜的破壞程度較大，部分患者仍有遺留視覺功能障礙和最終失明的風險[17]。抗VEGF 通過抑制異常新生血管增生治療早產兒視網膜病變，但可帶來眼內外不良反應。目前早產兒視網膜病變的治療手段主要針對血管增殖期，通過抑制或破壞新生血管達到治療目的[18]，但這一時期視網膜損傷已形成，故療效不理想。

本文對氧誘導視網膜病變乳鼠模型使用依達拉奉治療，發現與高氧誘導組比較，藥物治療組體重升高，視網膜SOD 活力升高，MDA 含量降低，視網膜VEGF、CD34 累積光密度值和平均光密度值降低；HE 染色顯示視網膜病變減輕；視網膜ADP 染色無灌注區面積減小。依達拉奉為神經保護藥物，對視網膜組織神經細胞具有保護作用[19-20]。依達拉奉也是一種強效抗氧化劑，清除自由基的能力很強，可通過清除氧自由基保護組織免受氧化應激損傷[21-22]。依達拉奉對視網膜病變也有保護作用，如AKIYAMA 等[23]發現依達拉奉可預防視神經損傷后小鼠視網膜變性；XU等[24]發現依達拉奉可通過PI3K/Akt/Nrf2 途徑保護視網膜免受缺血再灌注引起的氧化損傷；HIRONAKA等[25]發現載有依達拉奉的脂質體可保護視網膜免受氧化應激誘導的視網膜損傷。由此可見，依達拉奉具有抑制氧化損傷保護視網膜的作用。本研究結果表明，依達拉奉可減輕氧自由基對視網膜的損傷，抑制VEGF、CD34 的表達，從而抑制氧誘導視網膜病變乳鼠視網膜新生血管形成。初步分析依達拉奉可能通過抗氧化作用減輕氧誘導視網膜病變乳鼠氧自由基損傷，降低因氧自由基損傷導致的VEGF 表達水平升高，從而抑制視網膜新生血管形成，發揮對視網膜的保護作用。

綜上所述，依達拉奉對氧誘導視網膜病變具有保護作用，其機制可能與抑制視網膜氧化應激反應，從而抑制視網膜新生血管形成有關。