P2X7受體在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義*

吳丹，耿爽，胡軼

（華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院 呼吸與危重癥醫學科， 湖北 武漢 430014）

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因[1]，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%[2]。隨著早期診斷和治療方式的改進，NSCLC發病率有所下降，但5年生存率仍不盡人意[3]。尋找新的預后標志物，對改善NSCLC 預后尤為重要[4-5]。P2X7 受體是由位于12q24.31 位點的P2X7基因編碼的細胞膜外受體蛋白，相對分子質量約為120 kD，屬于P2X 受體家族成員，可由細胞外三磷酸腺苷激活[6-7]。P2X7R 與多種腫瘤遷移、侵襲及預后密切相關[8-9]。在胰腺癌中，P2X7R 表達可調節癌細胞存活和遷移，采用P2X7R 變構抑制劑可抑制胰腺癌細胞增殖和遷移[10-11]。然而P2X7R 在NSCLC 中的表達及預后鮮見報道且不完全[12-13]。本研究通過免疫組織化學法檢測NSCLC 患者癌組織中 P2X7R 的表達，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月—2014年1月在華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院行肺癌切除術的118 例患者組織標本。所有病理標本在納入研究前經2 位病理醫師根據NSCLC 病理分期（TNM 分期第8 版）標準[14]重新確認，共30 例患者接受術前新輔助化學治療（以下簡稱化療）。術后患者均按美國國立綜合癌癥網絡（national comprehensive cancer network, NCCN）指南進行后續化療，未接受分子靶向治療。納入標準：患者均接受NSCLC 切除術；除NSCLC 外，不存在其他部位的惡性腫瘤；有完整的臨床病歷資料和隨訪信息；按照NCCN 指南原則進行治療。本研究通過醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集從患者病歷資料中提取臨床病理資料，包括患者性別、年齡、吸煙狀況、腫瘤大小、組織學類型、淋巴結轉移及TNM 分期。

1.2.2 隨訪總生存時間定義為從術后至隨訪截止日或患者死亡時間的間隔。無瘤生存時間定義為從術后到首次隨訪發現復發或隨訪截止日的間隔。

1.3 免疫組織化學染色

將甲醛固定、石蠟包埋的病理組織切成4μm 厚切片，隨后將組織切片脫石蠟并在梯度乙醇中脫水。在pH 6.0 的乙二胺四乙酸緩沖液（武漢博士德生物公司）中煮沸3 min 行抗原修復。用3%過氧化氫（武漢博士德生物公司）淬滅內源性過氧化物酶活性30 min。使用P2X7R 單克隆抗體（英國Abcam 公司）在4℃條件下孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶綴合的二抗（美國Sigma-Aldrich 公司）在37℃條件下孵育2 h，用辣根過氧化物酶和3，3'-二氨基聯苯胺色原溶液（武漢博士德生物公司）處理載玻片并用蘇木精復染。

1.4 免疫組織化學評分

通過評估染色強度和密度來確定免疫組織化學評分：采用陽性細胞百分比結合染色強度對P2X7R表達水平進行評分。染色強度評分：0 分為陰性；1 分為弱陽性；2 分為中度陽性；3 分為強陽性。P2X7R 陽性細胞的百分比評分：1 分為0%～10%；2 分 為＞10% ～50%；3 分 為＞50% ～80%；4 分為＞80%～100%。將兩者得分相乘，計算出總得分，分值從0 ～12 不等。總得分≤3 分為P2X7R 低表達；≥4 分為P2X7R 高表達。其中，P2X7R 低表達組46 例，高表達組72 例。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，Cox 比例風險模型用于預后分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 組織中P2X7R 蛋白的表達

NSCLC 組織中P2X7R 蛋白陽性染色主要定位于NSCLC 細胞質和細胞膜上，72 例（61.0%）癌組織中P2X7R 呈高表達；46 例（39.0%）癌組織中P2X7R 呈低表達。見圖1。

圖1 NSCLC 組織中P2X7R 蛋白的表達（免疫組織化學染色×400）

2.2 不同影響因素下P2X7R 蛋白高表達率比較

不同性別、年齡、腫瘤大小、吸煙狀態、組織學類型、術前新輔助化療及術后化療患者的P2X7R 蛋白高表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而不同TNM 分期及有無淋巴結轉移患者的P2X7R 蛋白高表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 NSCLC 組織中P2X7R 蛋白表達與預后的關系

Kaplan-Meier 生存分析結果顯示，P2X7R 高表達組與低表達組無瘤生存率及總生存率比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=5.687 和14.687，均P=0.000），P2X7R 高表達組均低于P2X7R低表達組。P2X7R 高表達組5年無瘤生存率為18.1%，P2X7R 低表達組5年無瘤生存率為25.1%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=9.254，P=0.000），P2X7R 高表達組低于P2X7R 低表達組。P2X7R 高表達組5年總生存率為23.3%，P2X7R 低表達組5年總生存率為30.1%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=13.721，P=0.000），P2X7R 高表達組低于P2X7R 低表達組。見圖2。

表1 不同影響因素下P2X7R 蛋白高表達率比較（n =118）

2.4 影響NSCLC 患者無瘤生存率的單因素和多因素分析

單因素Cox 比例風險模型分析顯示，P2X7R 表達、TNM 分期及淋巴結轉移是影響NSCLC 患者無瘤生存率的危險因素（P＜0.05）。多因素Cox 比例風險模型分析表明，P2X7R 表達及TNM 分期是影響NSCLC 患者無瘤生存率的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

圖2 P2X7R 高、低表達組無瘤生存率和總生存率比較

表2 多因素Cox 比例風險模型分析影響患者無瘤生存率的因素參數

2.5 影響NSCLC 患者總生存率的單因素和多因素分析

單因素Cox 比例風險模型分析顯示，P2X7R 表達、TNM 分期及淋巴結轉移是影響NSCLC 患者總生存率的危險因素（P＜0.05）。多因素Cox 比例風險模型分析表明，P2X7R 表達及TNM 分期是影響NSCLC 患者總生存率的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 多因素Cox 比例風險模型分析影響患者總生存率的因素參數

3 討論

在我國肺癌發病率和死亡率均居惡性腫瘤的第1 位[15]，相對于西方發達國家，我國NSCLC 病死率更高，且呈逐年上升趨勢[16-17]。P2X7R 在人體多種細胞中表達，其中以干細胞、神經膠質細胞及內皮細胞表達最為顯著，參與調節炎癥、細胞增殖和凋亡、代謝及吞噬[18]。

本研究發現，118 例患者中61.0%的患者P2X7R呈高表達；39.0%患者P2X7R 呈低表達，這與最近報道結果類似[19]。有學者采用免疫組織化學和聚合酶鏈反應檢測94 例結直腸癌中P2X7R 的表達，發現高表達51 例，低表達43 例，結果顯示在不同腫瘤組織中P2X7R 存在表達差異[19]。本研究結果發現，NSCLC 組織中的P2X7R 表達水平與TNM 分期和淋巴結轉移相關，而與性別、年齡、腫瘤大小、吸煙狀態及組織學類型無關。BOLDRINI 等[13]報道，并未發現P2X7R 蛋白表達與臨床病理因素有相關性，原因可能與其研究所用的樣本量偏少及病理類型的異質性有關。

有研究報道，NSCLC 的TNM 分期和淋巴結轉移與患者疾病嚴重程度和腫瘤細胞侵襲性密切相關[4]。上述結果顯示，P2X7R 高表達的NSCLC 患者惡性程度更高。通過Kaplan-Meier 生存分析發現，P2X7R高表達的NSCLC 患者預后劣于P2X7R 低表達患者。Cox 比例風險模型分析提示，P2X7R 表達為影響無瘤生存率和總生存率的獨立危險因素。BOLDRINI 等[12]報道，P2X7R mRNA 的表達與NSCLC 預后相關，P2X7R mRNA 高表達的NSCLC 患者預后不良，與本研究結果類似。有文獻報道，在結直腸癌患者中P2X7R 高表達為影響結直腸癌術后患者總生存率的獨立危險因素[19]。盡管文獻報道在乳腺癌和前列腺癌的動物實驗中均發現P2X7R 表達增強，但并沒有P2X7R 表達與預后關系的報道[20-22]。

P2X7R 高表達導致NSCLC 臨床預后不佳的機制尚不清楚。其機制可能為：①在體外培養的前列腺癌細胞系中P2X7R 通過激活三磷酸腺苷參與上皮間質轉化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）[20]，而EMT 是NSCLC 發生、發展的關鍵步驟[21]，P2X7R 可能通過影響EMT 而影響NSCLC 的進展；②P2X7R高表達可誘導癌細胞侵襲和轉移，在體外培養的乳腺癌細胞系中，P2X7R 高表達或沉默分別促進或抑制乳腺癌細胞增殖能力[22]；③新血管形成是大多數腫瘤進展和轉移的先決條件，在胰腺癌模型中發現P2X7R高表達可促進胰腺癌細胞中新生血管形成[23-24]，其是否通過促進腫瘤血管生成參與腫瘤進展值得進一步研究。

本研究為單中心的回顧性研究，納入病例數較少，尚需要多中心大樣本研究來證實本研究結論；同時P2X7R 影響NSCLC 患者預后的分子機制尚需要進一步研究。

綜上所述，本研究發現NSCLC 組織中P2X7R高表達與患者惡性臨床病理特征及預后不良相關，P2X7R 高表達是NSCLC 患者預后不良的獨立危險因素。