慢性心力衰竭與IL-17A基因rs2275913、rs4711998位點多態性的關系

吳薇，李寧，李克研

（1.錦州醫科大學附屬第一醫院 心內科，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫科大學基礎學院生物化學教研室，遼寧 錦州 121000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure, CHF）是一種復雜的臨床綜合征，發生心臟結構和功能改變，包括心肌細胞死亡、纖維化和電生理重構[1-2]。免疫激活和炎癥參與了疾病的發生和發展，表現為多種炎癥因子循環水平升高[3-4]。IL-17 由CD4+T 細胞分泌，通過招募免疫細胞參與炎癥反應的放大[5]。基因遺傳變異可以改變基因的分子特征，改變某些疾病的風險。編碼IL-17A基因位于6 號染色體（6p12）上，相關研究已證實人類一些疾病發病風險與IL-17A基因多態性之間存在相關性，如多發性硬化癥、胃癌[6-8]。然而，對于IL-17A基因多態性在CHF 發生、發展中起到的作用研究甚少。本文旨在探討CHF 發病與IL-17Ars2275913（G-197A）、rs4711998（G-197A） 位點多態性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月—2019年3月于錦州醫科大學附屬第一醫院心內科的就診的CHF 患者131 例作為CHF 組。其中，男性75 例，女性56 例；平均年齡（57±48）歲。納入標準：①CHF 診斷標準參照Framingham 標準[9]，心功能NYHA 分級Ⅱ～Ⅳ級，超聲心動圖檢測LVEF＜45%；②年齡≥18 歲；③CHF病史≥3個月。排除標準：①4周之內發生過心肌梗死；②急性心力衰竭；③合并嚴重心臟瓣膜病變；④嚴重肝、腎功能損害及血液系統疾病；⑤嚴重貧血、甲狀腺功能亢進癥；⑥風濕性心臟病；⑦惡性腫瘤；⑧嚴重的急性感染或代謝紊亂。選取同期本院健康體檢者80 例作為對照組，其性別、年齡均與CHF 組相匹配。對照組經體檢后排除心血管疾病、嚴重肝或腎疾病、甲狀腺疾病、糖尿病。所有研究對象之間無血緣關系，且參與個體均已簽署知情同意書，并獲得醫院倫理委員會的批準。

1.2 基因型判定

1.2.1 標本采集和基因組DNA 的提取受試者抽取空腹外周靜脈血3 ml，將標本置于EDTA 抗凝管中并于-80℃冰箱保存備用。采用全血基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），按照說明書進行操作，DNA 樣本提取后置入-20℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms,SNP）鑒定PCR 引物序列由北京博邁德生物有限公司合成。IL-17A基因rs2275913 正向引物：5'-GCAGCTCTGCTCAGCTTCTAA-3'（21 bp），反向引物：5'-TTCAGGGGTGACACCATTTT-3'（20 bp）。rs4711998正向引物：5'-TTACACTCCAGCCATTGAG TTG-3'（22 bp），反向引物：5'-TGAAAATGGGGAT AGAGACTGG-3'（22 bp）。目的基因擴增PCR 擴增反應體系為25 ml，其中含有8μl DNA 提取物，正反向引物各1μl，2×Reaction Mix 12.5μl，Golden DNA Polymerase 0.25μl，剩余加入ddH2O。擴增反應條件：94℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30 個循環，72℃繼續延伸5 min，于4℃保存。用2.5%瓊脂糖凝膠和溴化乙錠染色將PCR 產物進行電泳，于紫外線透射儀下觀察是否擴增成功。IL-17A基因rs2275913（G-197A）位點應用內切酶EcoNI，并在37℃孵育15 min，rs4711998（G-197A）位點應用內切酶TaqI并在65℃孵育1 h，用3%瓊脂糖凝膠將酶切產物進行電泳，在紫外燈照射下觀察并記錄結果。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件，患者經χ2擬合優度檢驗是否符合Hardy-Weinberg（哈德溫伯格）平衡定律，以P＞0.05 為符合Hardy-Weinberg 平衡，表示研究樣本具有群體代表性[10]。基因型和等位基因頻率用基因頻率計數法比較，用χ2檢驗兩組間基因型和等位基因頻率分布。基因型與CHF 的發病因素比值比及95% CI 采用非條件Logistic 回歸分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-17A基因rs2275913、rs4711998位點PCR產物及基因型判定

PCR 產物電泳后在紫外燈下觀察，可見PCR 產物中分別有155 bp 和359 bp 大小的條帶（見圖1、2）。產物經內切酶酶切，于3%瓊脂糖凝膠電泳，7 號樣本分別為155 bp、87 bp 和68 bp，基因型為AG；1 號和2 號樣本2 條帶，分別為87 bp 和68 bp，基因型為GG；3 號和5 號樣本僅有155 bp 條帶，基因型為AA（見圖3）。5 號樣本分別為359 bp、206 bp 和153 bp，基因型為AG；1 號和2 號樣本2 條帶，分別為206 bp和153 bp，基因型為GG；3 號和4 號樣本僅有359 bp條帶，基因型為AA（見圖4）。

圖1 IL-17A 基因rs2275913 PCR 產物

圖2 IL-17A 基因rs4711998 PCR 產物

圖3 IL-17A 基因rs2275913 PCR 產物酶切分型鑒定

圖4 IL-17A 基因rs4711998 PCR 產物酶切分型鑒定

2.2 CHF 組IL-17A 基因rs2275913、rs4711998位點與對照組實際、預期基因頻率比較

CHF 組IL-17A基因rs2275913 實際與預期基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；對照組實際與預期基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），說明研究樣本具有群體代表性。CHF 組IL-17A基因rs4711998 實際與預期基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；對照組實際與預期基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），說明研究樣本具有群體代表性。見表1。

2.3 兩組IL-17A 基因rs2275913、rs4711998位點各基因型及等位基因頻率分布比較

兩組IL-17A基因rs2275913 位點AA、AG及GG 基因型比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；且其A、G 等位基因頻率分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組IL-17A基因rs4711998 位點AA、AG 及GG 基因型比較，差異無統計學意義（P＞0.05），且其A、G 等位基因頻率分布比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 IL-17A基因rs2275913、rs4711998 位點SNP與CHF的Logistic回歸分析

采用非條件二分類反應變量的Logistic 回歸分析，自變量為各組基因型，因變量為是否患有心力衰竭，以GG 基因型為參照，可見IL-17A基因rs2275913 位點攜帶AA 基因型的個體患CHF 的風險是攜帶GG 基因型個體的4.410 倍。CHF 組IL-17A基因rs2275913（G-197A）位點攜帶A 等位基因頻率高于對照組（P＜0.05）。未發現IL-17A基因rs4711998 位點SNP 與CHF 發病有關（均P＞0.05）。見表3。

表1 CHF 組IL-17A 基因rs2275913、rs4711998 位點與對照組實際、預期基因頻率的比較 %

表2 兩組IL-17A 基因rs2275913、rs4711998 位點各基因型及等位基因頻率分布比較 例（%）

表3 IL-17A 基因rs2275913、rs4711998 位點SNP 與CHF 的Logistic 回歸分析參數 例（%）

3 討論

IL-17A 是一種多效細胞因子，一方面通過募集中性粒細胞與Th17 分泌的其他細胞因子（如IL-6 及腫瘤壞死因子）協同誘導炎癥；另一方面其可以產生炎性介質，如刺激上皮細胞和內皮細胞等[11-14]。IL-17A 在多種心血管疾病的發生、發展中起到一定作用，裴芳等[15]研究證實IL-17A基因rs2275913 位點A 等位基因是病毒性心肌炎的易感基因。同樣，唐輝等[16]研究證實IL-17A基因SNP 與擴張型心肌病的遺傳易感性有關。SHUANG 等[17]發現rs2275913 位點的AA 基因型及A 等位基因的個體與患冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的風險有關聯。目前，有研究報道IL-17A基因rs4711998 位點與多種疾病的相關性，如與哮喘、巨細胞動脈炎的發病相關[18-19]。然而，還沒有證據支持其在心力衰竭中的作用。哈德溫伯格平衡定律應用于理想群體，筆者從理想群體出發并使理論分析結果接近于客觀真實群體的情況，從而獲得真實群體遺傳的一般規律[10]。本研究結果顯示，IL-17A基因rs2275913、rs4711998 位點AA、AG 和GG 基因型在CHF 組和對照組中實際與預期基因頻率分布比較無差異，表明兩組研究樣本均具有群體代表性。本研究顯示，大部分CHF 患者IL-17A基因rs2275913 位點基因型多為AG 或AA，且攜帶A 等位基因的頻率明顯高于對照組，其患病風險也顯著增加。本研究結果提示CHF 的發病與IL-17A基因rs2275913 位點SNP 相關，這表明G-197A 的變化導致IL-17A基因表達，擾亂了調節生物效應的機制，致使免疫狀態發生改變并在多種刺激誘導下發生心肌損害、心肌纖維化及心室重構。這與SANDIP 等[20]報道的結果不一致，造成這種差異的潛在原因是被調查人群中不同種族、不同地區間突變的差異。

綜上所述，IL-17A基因rs2275913 位點多態性可能與CHF 的發病有關，而且該位點可能影響基因的轉錄和表達。然而，這項研究有幾個局限性。首先，本研究由于樣本量偏少，其次特定區域的抽樣不能反映其他區域的情況。因此本研究仍需進一步擴大樣本量，進行多中心、多群體及多位點的前瞻性研究來驗證IL-17A基因與CHF 發生、發展的關系。