生物農藥多殺菌素及其結構類似物的研究進展

張逍遙，郭 超，劉艷麗，張 鑫，王 超*

（1. 國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037；2. 北京城市學院 生物醫藥學部，北京 100083）

隨著化學工業的快速發展，化學合成農藥已在農業中廣泛應用，但長期大量使用導致害蟲抗藥性不斷提高，其高殘留對環境造成嚴重污染。2019年中共中央、國務院發文明確，5年內淘汰現存的氯化苦、磷化鋁等高毒農藥。國家大力鼓勵并出臺政策支持“綠色、無污染、健康”的新型生物農藥的研發和推廣。生物農藥是指利用生物產生的天然活性物質或生物活體本身制作的農藥，有時也將天然活性物質的化學衍生物等稱作生物農藥[1]。我國生物農藥的類型主要有微生物農藥、抗生素農藥、植物源農藥和生物化學農藥等。因生物農藥具有選擇性強，對人畜及非靶標生物安全、環境中易降解等優點，在蟲害防治領域廣泛應用。據統計，我國生物農藥已登記超100個有效成分、近5 000種產品，其中包括具有殺蟲、殺螨及殺線蟲活性的大環內酯類抗生素阿維菌素，以及兼具生物農藥安全性和化學合成農藥速效性的多殺菌素等。隨著人們環保意識的提高及對食品安全的高度關注，生物農藥占全球農藥總份額比例將越來越高[2]。

多殺菌素是20世紀90年代初由陶氏益農公司開發的一種大環內酯類殺蟲抗生素，因具有較高的殺蟲選擇性和環境兼容性，1999年獲得美國“總統綠色化學品挑戰獎”（presidential green chemistry challenge award）。作為第二代殺蟲劑的乙基多殺菌素，不但對蔬菜作物的殺蟲效果明顯，亦能有效防止水果和堅果等作物上的蟲害，尤其是對梨果類果樹上一種棘手的主要害蟲——蘋果蠹蛾有特效，并于2008年再次獲獎。多殺菌素及其結構類似物作為一類高效安全的生物殺蟲劑，在防治農林害蟲、儲糧害蟲、衛生害蟲以及牲畜寄生蟲上面發揮著重要作用。相信同多殺菌素一樣綠色安全的結構類似物乙基多殺菌素、丁烯基多殺菌素等，也將擁有更大的市場應用價值。本文主要比較多殺菌素及其結構類似物的理化特性，總結其理化誘變、分子改造、產品研發與應用以及抗性研究等方面的進展，分析生物農藥推廣的現狀和存在問題，提出解決思路，并對其發展前景進行展望。

1 多殺菌素及其結構類似物的特性比較

1.1 理化特性

如表1所示[3-9]，多殺菌素是大環內酯類的天然發酵代謝產物，spinosad A（約占85%～90%）和spinosad D（約占10%～15%）是其主要活性成分。于2007年底推出的乙基多殺菌素產品得益于人工神經網絡（ANN）[10]，它是美國陶氏益農公司在多殺菌素的基礎上研制的殺蟲劑，其原藥有效成分為乙基多殺菌素J（75.5%）和乙基多殺菌素L（20.7%）的混合物。在1999年發現的須糖多孢菌代謝產物——丁烯基多殺菌素，因其與多殺菌素的區別在C21位由丁烯基取代了乙基[11]，這一結構上的相似性使得二者的理化性質和作用機理相近。主要作用于煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor, nAchR）和 γ–氨基丁酸受體（γ-amino-hutyric acid receptor，GABA），通過刺激害蟲的神經系統從而引起興奮，導致非功能性的肌肉收縮、顫抖、衰竭和麻痹等，最終致其死亡。

1.2 殺蟲譜

乙基多殺菌素能有效解決多殺菌素防治果樹害蟲效果不明顯的問題，如對水果、堅果、蔬菜上的梨小食心蟲、卷葉蛾、甜瓜薊馬[12]、蘋果蠢蛾等均有良好的防治效果。丁烯基多殺菌素和多殺菌素兩者均具有殺蟲、殺螨、殺虱活性，但丁烯基多殺菌素比多殺菌素具有更寬的殺蟲譜，能有效的控制膜翅目、鱗翅目、纓翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲，對鱗翅目、纓翅目具有較強的選擇性殺蟲活性，對于多殺菌素難控制的對農作物危害極大的煙青蟲、蘋果蠹蛾、馬鈴薯甲蟲等卻能有效防治，其有望成為新一代多殺菌素類高效殺蟲劑。

1.3 生物合成基因

多殺菌素的全基因組測序已于2011年完成，多殺菌素的生物合成途徑已基本闡明，生物合成基因簇已被克隆和測序，大部分基因的功能已確定[10-11]。多殺菌素的生物合成共涉及23個基因，除 NDP–鼠李糖合成酶基因外，大部分成簇排列在長約74 kb的基因簇中[13]，并以spn命名。它的生物合成共涉及四個部分：以丙酸開始的共 5個基因（spnA-E）參與聚酮鏈合成，4個基因（spnF-M）參與的大環內酯核分子內的交聯反應，鼠李糖糖基的轉移和甲基化過程共4個基因（spnG-I）參與以及 6個基因（spnN-S）參與福樂胺糖糖基的合成和連接。在明確生物合成涉及到的基因后，可以通過改變鼠李糖和福樂胺糖，合成多殺菌素新衍生物方法來獲得新的化合物，提高殺蟲活性和拓寬殺蟲譜。

表2 多殺菌素及其結構類似物殺蟲譜

為了開發更高效、更廣譜的多殺菌素衍生物，研究人員在明確了多殺菌素生物合成的中間體和途徑后，應用人工神經網絡對其生物活性進行定量–構效關系分析（quantitative structure-activity relationship，QSAR）時發現，多殺菌素中鼠李糖–3’–O–乙基化進行改造可以明顯提高其生物活性，因此將多殺菌素5,6–雙鍵的氫化與鼠李糖–3’–O–乙基化進行組合，成功研發出主要成分為 3’–O–乙基–5,6–二氫多殺菌素J的乙基多殺菌素[14]，最終通過半合成修飾獲得的乙基多殺菌素，其是由質量比為 3∶1的 3’–O–乙基–5,6–二氫多殺菌素 J與 3’–O–乙基多殺菌素 L組成的混合物。這一系列的結構修飾使得乙基多殺菌素不僅保留了多殺菌素的殺蟲活性和對環境及哺乳動物安全友好的特點，更擁有了廣闊的殺蟲譜，并再一次獲得了2008年的“總統綠色化學品挑戰獎”。

為探求丁烯基多殺菌素的合成途徑，以刺糖多孢菌基因作為探針，發現了相關的合成基因長約110 kb，共23個基因，與編碼多殺菌素的基因序列高度相似。聚酮合成酶基因是由busA～E共5個頭尾相連的基因構成的基因簇，負責合成大環內酯結構；busJ、busF、busL、busM共4個基因，負責將大環內酯修飾為糖苷配基；鼠李糖由gtt、gdh、epi、kre、busG這5個基因編碼合成并添加，busH、busI、busK這3個基因使鼠李糖甲基化，busN～S是福樂糖胺合成的相關基因[11,15-16]。在丁烯基多殺菌素基因簇的兩側還克隆到了 9個多殺菌素基因簇所沒有的基因，它們可能與一些特異的丁烯基多殺菌素的形成有關[4]。

1.4 產生菌的生物學特性

1.4.1 刺糖多孢菌的菌種特性

多殺菌素的產生菌，刺糖多孢菌是好氧型革蘭氏陽性放線菌，其菌株在大多數培養基上都會產生良好的氣生菌絲，菌絲在液體培養基中呈現碎片狀。電鏡下的刺糖多孢菌表面被針狀刺，外形為獨特的串珠狀。它能有效利用碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、D–赤藻糖醇、甘油、甘露醇等）產酸和氮源（胨化牛奶、牛肉膏、棉籽蛋白等），同時在發酵培養過程中添加菌體所需的無機鹽等元素可供其快速生長，對溶菌酶敏感。最佳的培養和產孢溫度為 24～33 ℃，當溫度在28～30 ℃時適合代謝產物的合成，此外溶氧量也會對發酵過程產生極大影響[17]。值得注意的是，因為有些菌株經冷凍干燥后會慢慢失去產孢能力，所以通常以砂土管真空保存。

1.4.2 須糖多孢菌的菌種特性

丁烯基多殺菌素的產生菌由于對糖多孢菌屬（saccharopolyspora）的特殊噬菌體敏感，且其孢子在電鏡下呈現毛刺等形態學特征而被命名為須糖多孢菌。該菌為好氧型菌，在24～33 ℃可適宜生長。在ISP2和ISP5培養基上產生氣生菌絲和亮白色的多毛刺孢子，菌絲體在液體培養基中易斷裂。須糖多孢菌與刺糖多孢菌一樣都能利用海藻糖、D–赤藻糖醇、果糖、葡萄糖、甘油、甘露醇等碳源產酸，不同的是對于乳糖、麥芽糖、松三糖、蜜二糖、棉子糖、水楊苷核糖醇、D–半乳糖、糊精等無法產酸[3]。

2 多殺菌素及其結構類似物的研究進展

2.1 高產菌株的誘變選育

對多殺菌素及其結構類似物在分子結構、理化性質、殺蟲機理等有一定了解的基礎上，其高產菌株的產量決定了它的工業化前景。篩選高產菌株的常規誘變技術包括：紫外（UV）誘變，亞硝基胍（NTG）誘變，60Co-γ[18]誘變、離子束誘變、常壓室溫等離子體（ARTP）誘變、復合誘變選育等。此外，微生物的抗生素抗性突變可賦予突變株新生次級代謝產物的代謝生產能力，并以96孔板發酵培養結合生物檢測進行高通量篩選能大幅提高篩選效率[19]。

常用的誘變劑亞硝基胍（NTG）是具有一定毒性的烷化劑，陳園[19]以 NTG對刺糖多孢菌進行誘變，最終在誘變劑量 2 mg/mL、處理時間50 min時獲得產量提高 43.96%的多殺菌素高產株。當采用諸多組合的復合誘變時可以有效提高突變株的次級代謝產物產量，如通過 UV、NTG結合鏈霉素、安普霉素、鼠李糖抗性因子誘變選育的高產株產量提高了45.71%[20]；MPMS結合鏈霉素、慶大霉素、利福平、氯霉素四種抗生素抗性篩選多殺菌素高產菌株產量提高28.68%[21]。但是誘變選育的高產菌株的遺傳存在不穩定性，特別是多殺菌素高產性狀易丟失，所以采取屬間原生質體融合等引入外源基因的方法可有效改善基因穩定性的問題[22]且有研究使多殺菌素產量提高了331%[23]。

陳爽[24]為提高丁烯基多殺菌素產量，對須糖多孢菌以5 mg/mL的NTG誘變50 min篩選出1株遺傳穩定且產量提高 86.7%的菌株。對須糖多孢菌進行不同濃度的鏈霉素篩選研究，結果顯示4×MIC濃度的突變株菌絲體粗壯、分支增多，有利于丁烯基多殺菌素的積累，產量提高1.79倍[25]。鄔洋[26]開展的 10×MIC濃度的巴龍霉素抗性篩選研究中，抗性突變株的產量是原始菌株的 2.2倍。為獲得更高產的工程菌株，研究者進行10×MIC濃度的鏈霉素–慶大霉素雙重抗性選育，該突變株的產物峰面積是起始菌株的3.89倍[27]。

2.2 基因工程改造高產突變株

與傳統的理化誘變技術不同的是，基因工程改造方法在提高菌種代謝產物產量方面具有更加準確的方向性和目的性。通過調節生物合成途徑中的相關基因，可以顯著提高生物合成產量，并且通過抑制次要組分的合成，也可提高主要有效成分的產量。

迄今為止，在刺糖多孢菌中引入生物合成簇和鼠李糖合成的相關基因，是大多數以基因工程為手段來提高多殺菌素產量的主要方法。如引入過度表達的fadE和fadD1增強了刺糖多孢菌的脂肪酸降解速率，其多殺菌素在含油培養基中有顯著提高[28]。多殺菌素J和L與A和D結構上的差異為鼠李糖殘基上3′–O位點上的甲基。前人研究證實其生物合成基因簇中spnI、spnK、spnH分別參與多殺菌素鼠李糖殘基上不同位點的甲基化修飾。因此，黨福軍[29]建立了刺糖多孢菌的基因敲除技術（即去除spnK編碼保守區域序列），在工業菌株中構建了spnK失活的突變株，可以大量產生多殺菌素J和L。

研究者們為圍繞提高丁烯基多殺菌素產量，根據前期基因組測序表明須糖多孢菌含有fcl基因和padR基因，開展了敲除padR的研究，使得菌體轉運蛋白表達水平上調，促進提產27.3%[30]。而敲除fcl雖影響了菌絲體的生長發育，但促進了其生物合成和殺蟲活性，相較野生型菌株產量提高了 130%[31]。使多核苷酸磷酸化酶過度表達也可促進了菌株的生物量，丁烯基多殺菌素產量提高了1.92倍[32]。

2.3 高產菌株的發酵優化

通過優化發酵培養基，改善發酵環境，可以縮短發酵時間，延長代謝產物合成期，提高發酵產量。對于發酵條件優化最好的方式就是采用以表格化直觀的數理統計法對發酵過程建立相關的數學模型，通過適時調節發酵參數，實現對發酵過程的優化控制。目前常借助的統計學方法包括：單因素實驗法、響應面分析法、人工神經網絡建模法等，通過統計學方法篩選最佳培養基配方，是提高代謝產物產量最直接、簡單、高效的方法。

研究者們為了提高多殺菌素的產量，對碳源、氮源、前體、培養溫度及溶氧量等進行優化，取得一定進展：研究人員嘗試添加油脂類[33]、氨基酸類和有機酸類成分來滿足刺糖多孢菌的生長需求[34]，使得產生菌在原有發酵水平上有了較大幅度提高。采用人工神經網絡結合粒子群算法優化產多殺菌素的發酵培養基，和利用響應曲面及其等高線對提取效果各種關鍵因素進行探討，達到提產目的，并獲得最優提取條件[35-36]。

碳源對須糖多孢菌生長及次生代謝產物的生物合成起著至關重要的作用，研究者們為提高丁烯基多殺菌素產量，常通過優化碳源、氮源等以達到該目的。陳爽[24]對經 NTG誘變和高通量篩選后的高產菌株進行單因素實驗和正交實驗來優化發酵培養基配比，最終獲得的最佳配方使菌株的丁烯基多殺菌素產量比優化前提高 52.1%。通過對 11種常見碳源進行代謝途徑分析后得到以5 g/L的甘露糖作為碳源添加時，顯著提高了丁烯基多殺菌素的產量1.78倍[37]。

2.4 產品應用情況

2.4.1 大田蟲害的防治

1994年陶氏益農公司將率先向美國環保總局（EPA）上報并得到優先登記注冊的多殺菌素產品“Naturalyte”和“Tracer”推入市場，其分別用于果樹、蔬菜和防治催殺棉花田和煙草中鱗翅目類害蟲[38-39]。目前該類產品已成功在80多個國家登記注冊，可用于防治超過200種害蟲。在我國上市的多殺菌素產品有用于棉花類的“催殺”（spinosad 48%）懸浮劑和用于果蔬類的“菜喜”（spinosad 2.5%）懸浮劑。

2007年新西蘭獲批的商品Delegate（spinetoram 25%）陸續上市，常被用于堅果、水果、蔬菜類作物。其水分散粒劑也被用于防治蘋果樹害蟲。隨后，以商品名為Delegate WG（spinetoram 25%）和Radiant SC（spinetoram 120 g/L）獲得加拿大政府和美國政府的審核批準用于防治瓜果蔬菜、谷物類作物的害蟲。

多殺菌素與乙基多殺菌素對害蟲均具有胃毒和觸殺作用，殺蟲活性高，主要用于防治田間鱗翅目害蟲（小菜蛾、甜菜夜蛾）及纓翅目害蟲（薊馬）、雙翅目害蟲等。如其均可以防治田間的多食性害蟲草地貪夜蛾，殺蟲防效與保葉效果為100%[38-40]。若與蟲生真菌聯合使用，可以達到協同增效的目的[41]。以玉米粉為基質制成的多殺菌素顆粒劑可延長農作物的貨架期[42]。

2011年在中國與全球同步上市的艾綠士懸浮劑（spinetoram 60 g/L），其主要成分是乙基多殺菌素，已在國內登記用于茄子防治薊馬、甘藍防治甜菜夜蛾與小菜蛾、水稻防治稻縱卷葉螟等[43]。它對菜田中的小菜蛾以及蔬菜薊馬具有很好的速效性和持效性，在施藥的第一天就達到較好防治水平，且第七天防效仍在90 %以上[44-45]。

2.4.2 儲糧蟲害的防治

由于儲糧害蟲為害引起的糧食損失是威脅我國糧食安全的重要因素，特別多發于儲藏設施落后的農村。害蟲的爆發不僅會造成糧食損失，它們的排泄物、尸體還會使糧食發霉變質，甚至產生對人體有害的物質。單一的長期大量使用化學農藥熏蒸劑使害蟲產生了嚴重的抗藥性，已經無法有效的防治害蟲，因此我國儲糧防治迫切需要新型的無公害防治技術。

2003年多殺菌素在肯尼亞被第一次注冊登記為儲糧保護劑，隨后2005年在美國注冊成為儲糧殺蟲劑，可以在多種糧食和種子上應用。大量研究顯示1 mg/kg多殺菌素對玉米、綠豆、小麥等糧庫中玉米象、谷蠹等常見的儲糧害蟲有顯著的防治效果，即使是炎熱高溫的夏季，也可保證儲糧無蟲害[46]。若使用多殺菌素熏蒸或復配劑還可延長糧食保質期和增強殺蟲活性[47-48]。可在農戶儲糧、大型糧倉或者簡易糧倉中推廣使用。

乙基多殺菌素多使用于田間，在儲糧害蟲防治上的應用較少。對于小麥中銹赤扁谷盜[49]，煙葉中煙草粉螟[50]，糧倉中谷蠹、書虱等均能有效防治，且控制效果同多殺菌素基本一致。因此在儲糧有害生物防治領域具有很大的研究開發潛力。

2.4.3 生活與衛生害蟲的防治

海港周邊的城市經常受到蚊蟲的吸血肆虐，更重要的是它們的傳播會帶來瘧疾、流行性乙型腦炎等流行病的發生。綜合治理策略是蚊蟲控制的基本原則，化學防治雖然快速高效，但長期大量不合理的使用，導致蚊蟲產生抗性[51]，引發防治效果差、施藥量增大、環境污染等問題。而多殺菌素的緩釋粒劑 Natular G30對致倦庫蚊的防治效果較好，且對水生生物安全[52]，作為一種環境友好型殺蟲劑，值得在我國推廣使用。

頭虱是一種寄生性昆蟲，主要存在于人們的毛發內，以吸食人血為食，感染在美國兒童及成年人十分普遍。2011年美國FDA批準的Natroba（0.9%多殺菌素混懸液制劑），是用于治療4歲以上兒童及成年人頭虱感染的外用制劑[53]。在經14天的用藥治療后治愈率（即完全無頭虱個體的比率）達86%，它的上市為治療頭虱提供了一種新的選擇。

2.5 多殺菌素類藥劑的抗性研究

自多殺菌素上市以來，陶氏益農公司就建議農民不要重復使用該殺蟲劑，并且鼓勵與其他產品輪換使用來避免多殺菌素產生抗性。雖然多殺菌素類化合物的作用機制獨特，一些獨具生物學特性和危害習性的害蟲還是表現出明顯的抗藥性。如北京地區西花薊馬田間種群對多殺菌素的抗性倍數達到80～150倍，對乙基多殺菌素抗性倍數高達7 730倍[54]。該田間監測表明靶標害蟲對多殺菌素類殺蟲劑的抗性有著不容忽視的影響，了解抗性發展規律對以后的抗性治理有著重要的意義。

對于抗性機理，有觀點提出代謝解毒酶或許在抗性中起作用，并研究了羧酸酯酶、谷胱甘肽硫轉移酶和多功能氧化酶這3種解毒酶的活性，但在西花薊馬對多殺菌素的抗藥性中認為并非如此[55]。還有研究發現，煙堿型乙酰膽堿受體 α6亞基跨膜區的三個氨基酸缺失導致小菜蛾對多殺菌素產生高水平抗性[56]。并且殺蟲靶標位點的不敏感性，也是導致害蟲對殺蟲劑產生抗性的一個重要的生化機制。

害蟲抗藥性是防治過程中必須要面對的一個重要關卡，在尚未找到行之有效的治理方法之前，采用合理用藥與加強田間害蟲抗性的監測可以延緩抗性發展，尋求新型殺蟲劑并聯合更多措施來防治害蟲侵害刻不容緩。

3 前景展望

3.1 生物農藥推廣的現狀和存在問題

近年來，我國生物農藥產業的開發與應用得到了國家和政府的大力支持，通過國家科技支撐計劃、公益性行業科研專項、重點研發計劃項目等進行資助來推動生物農藥資源的研發[1]。可盡管如此，生物農藥的普及和應用步伐仍十分滯緩，與歐美發達國家相比存在不小的差距。除了生物農藥政策制度不健全外，其產品本身也存在著生物農藥制品種類少、研發成本高、防治譜窄等制約因素。作為科研人員，我們不僅要盡快解決提取培育成本高的問題，更重要的是大力開發新的活性化合物和衍生物，這是當前和今后發展的熱點領域。

3.2 解決思路

3.2.1 復配劑的研發

生物農藥的研發為綠色有機農業提供了安全生產的技術支撐，不僅增加了農業產量，也提高了農作物的質量，減輕了水土污染等環境壓力。但是，生物農藥的應用技術和使用面積仍是亟待解決的問題。對于大多數生物農藥存在的對靶標生物明顯選擇性，甚至是專一性，可以通過研究將新型生物源殺蟲劑與傳統殺蟲劑按一定比例組合復配，發揮各自優勢，而從減緩害蟲抗藥性和延長藥劑的使用壽命。已有研究將多殺菌素與毒死蜱 7:5復配后表現出明顯的增效作用[57]，與吡蟲啉以1:20濃度比組成的混劑也可用于韭菜遲眼蕈蚊幼蟲的防治[58]。

3.2.2 新活性化合物和衍生物的開發

豐富種類，開發新的活性化合物和衍生物（如丁烯基多殺素），也可以解決當前防治殺蟲譜窄，產品種類少的方法。為了篩選多殺菌素類似物，郭超[59]等從采集到的162份土壤樣品，分離獲得了15 000余株放線菌建立放線菌庫，利用高通量發酵平臺及蚊子幼蟲生物測定的方法篩選具有殺蟲活性的微生物，獲得一株產丁烯基多殺菌素的須糖多孢菌，并進行了16s RNA鑒定、全基因組序列測定、理化誘變等研究工作。但須糖多孢菌生長慢、生物量低、發酵過程調控難，丁烯基多殺菌素產量仍然較低，達不到工業化生產要求。目前國際上無丁烯基多殺菌素相關產品注冊登記的報道，作為繼第一代多殺菌素、第二代乙基多殺菌素之后的第三代生物農藥，丁烯基多殺菌素在延緩害蟲抗藥性、擴大殺蟲譜等方面將展現其潛力。

隨著人類環保和生態意識的增強，以及現代生物技術的飛速發展，新型生物農藥的的性能和品質會不斷提高，高效低毒、特異性強的新生物農藥品種的發展前景會更加美好。