不同濃度乙醇對人精子形態、前向運動力和DNA碎片指數影響的體外實驗研究

許鵬宇， 李冬秀，郭瑞娟，程立立

（河北醫科大學第三醫院生殖醫學科，石家莊 050051）

不良生活方式對男性生育力的潛在影響越來越受到廣大學者的重視，尤其是飲酒。乙醇對男性生育力產生不利影響，具體的影響機制仍不清楚[1]。有學者認為乙醇通過干擾性腺軸的激素分泌、附屬性腺的功能以及對睪丸直接毒副作用，從而影響精液質量[2-4]，但也有研究認為飲酒不影響男性精液質量[5]。以上研究絕大多數基于研究對象飲酒后的生育力評估，鮮有文獻報道乙醇對體外精子的直接影響。本課題搜集30 份門診檢查正常的廢棄精液，采用密度梯度離心法處理精液后將回收的精子混懸于含不同濃度乙醇的精子培養液1005 中，6h 后檢測各組精子的前向運動精子前向運動能力、正常形態精子比例以及精子DNA 碎片指數（DNA fragment index，DFI）的變化，探討乙醇對體外培養精子的直接影響，為我們的臨床工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2018年6月～2019年3月在我院生殖門診就診的男性患者，年齡18～35 歲，排除高血壓、冠心病、慢性腎病等慢性疾病患者；經男科醫生專科查體，生殖器發育正常、無精索靜脈曲張、近期無泌尿生殖系統感染；禁欲2～7 天，精液常規、形態檢測正常；無吸煙、飲酒、藥物濫用等不良嗜好者。

1.2 儀器與試劑 精子活力檢測系統（北京偉力）；相差顯微鏡（OLYMPUS）；精子染色液（深圳華康）；精子核DNA 完整性檢測試劑盒（深圳華康）；精子沖洗液（美國SAGE）；梯度離心培養液（美國SAGE）；無水乙醇（天津永大）。

1.3 方法

1.3.1 精液處理：患者采用手淫法取精，將符合標準的30 份精液進行密度梯度離心。15ml 的錐形離心管先加入1ml 80%的密度梯度液，再緩慢加入1ml 40%的密度梯度液，將2ml 混勻的精液緩慢加入梯度液上方，300g 離心20min。離心后去精液及梯度液，將精子沉淀混懸于2ml 的1005 中，混勻，300g 離心5min。離心后去上清，將精子沉淀重新混懸于1005 中，調整濃度至（10 ～50）×106/ml，實驗組將精子混懸于不同乙醇濃度的1005中培養。乙醇終濃度分別為對照組0mg/dl（A 組），實驗組（低濃度）20mg/dl（B 組）、C 組（中濃度）80mg/dl、D 組（高濃度）160mg/dl。將精子混懸液置于35℃的二氧化碳培養箱中，6h 后檢測精子前向運動力、形態及精子DFI。

1.3.2 精子前向運動力和精子形態的檢測：應用偉力精子活力檢測系統進行精子活力分析，采用diffquick 染色法對精子進行染色，1 000 倍顯微鏡下行精子形態分析。所有操作均由兩名經驗豐富的男科實驗室人員共同完成，嚴格參照WHO《人類精液及精液-宮頸黏液相互作用實驗手冊》（5 版）的標準進行。

1.3.3 精子DFI 檢測：應用精子染色質擴散法對精子核DNA 完整性進行檢測。試劑購于深圳華康，操作參照說明書進行。結果判讀：常規顯微鏡下觀察400 個精子，暈環寬度/精子頭直徑≥2/3 為大暈環，＞1/4 且＜ 2/3 為中暈環，≤1/4 為小暈環，觀察不到暈環為無暈環。大暈環和中暈環表示精子核DNA 完整，小暈環和無暈環表示精子核DNA斷裂。計算方法：DFI=（大暈環+中暈環精子數）/全部計數精子×100%。

1.4 統計學分析 應用 SPSS 17.0 統計軟件進行數據處理。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOV）進行顯著性分析，對多組間有顯著性差異的采用LSD 法進行方差分析中的兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度乙醇對精子活動力和形態的影響 隨著乙醇濃度增加，前向運動精子比例逐漸下降 （A組73.03%±2.83%，B 組63.13%±4.22%，C 組53.03%±3.05%，D 組45.07%±2.97%），采用單因素方差分析，差異有統計學意義（F=283.454，P=0.000），對各組進行兩兩比較，各組間差異均有統計學意義（均P=0.000）。正常形態精子隨著乙醇濃度的增加而降低（A 組10.23%±2.48%，B 組9.60%±2.13%，C 組8.03%±1.96%，D 組5.23%±1.23%），差異有統計學意義（F=20.757，P=0.000），B 組正常形態精子比例與對照組、C 組相比，差異無統計學意義（P=0.128，0.295）；C組、D 組正常形態精子低于A 組，差異有統計學意義（P=0.011，0.000）。

2.2 不同濃度乙醇對精子DFI 的影響 隨著乙醇濃度增加精子DFI 升高（A 組12.37%±3.68%，B 組12.67%±3.78%，C 組15.70%±4.06%，D 組20.30±5.06%），采用單因素方差分析，差異有統計學意義（F=8.979，P＜0.001）。組間兩兩比較，D 組精子DFI 高于A 組、B 組和C 組，差異有統計學意義（P＜0.001，P＜0.001，P=0.001），而B 組、C 組精子DFI 雖然高于A 組，但差異均無統計學意義（P=0.804，0.339），B 組與C 組精子DFI 比較，差異亦無統計學意義（P=0.478）。

3 討論

雖然血睪屏障為精子的發生提供適宜的微環境，但有研究報道乙醇可以破壞睪丸的結構從而影響精子的生成[6]。精子的發生是一個涉及神經內分泌、附屬性腺和睪丸的復雜過程，盡管許多研究發現飲酒等不良習慣與精液質量相關[6-7]，但是乙醇對男性精子的影響機制仍不明確。為了去除乙醇通過性腺軸及睪丸的生精功能對精子的影響，觀察乙醇與精子直接接觸對精子的影響，本課題組通過嚴格篩選，將30 份正常精液處理后放入含不同濃度乙醇的精子培養液中培養。結果發現，精子與乙醇直接接觸，對精子活力影響較大，培養液中乙醇濃度越高精子前向運動能力下降越明顯。一項關于347 例男性短期飲酒的橫斷面研究發現，5日內酒精攝入越多，精液質量越差[8]，這與我們的觀點一致。文獻報道每日飲酒與偶爾飲酒的男性相比，前者精液質量顯著降低[9]，這可能是每日飲酒引起乙醇及其代謝產物在體內蓄積，從而引起精子質量下降。與精子前向運動能力相比，精子形態在低濃度乙醇時無顯著改變，但是在中、高濃度乙醇作用下精子正常形態顯著降低，因此我們推測乙醇對精子形態的影響小于精子前行運動能力。臨床工作中飲酒患者檢測精液，前行運動精子比例最先受到影響，大量飲酒后精子形態學檢測也會受到影響。本課題雖然排除了激素、內分泌等因素對實驗結果的影響，但是飲酒后乙醇在體內吸收代謝是一個復雜的理化過程，其結論不能完全代替體內實驗。也有學者認為飲酒不影響男性精液質量[5,10]，因此對于乙醇對精液常規參數的影響，尤其飲酒后對精子質量的影響仍需進一步研究。

精子DNA 碎片指數（DFI）是近年來生殖醫學領域評估精子質量的新指標，當DFI 過高時會引起受精異常[11]，甚至胚胎發育停滯。有研究顯示活性氧（ROS）與DFI 密切相關，飲酒、吸煙等不良生活習慣會增加ROS 含量，從而影響細胞線粒體功能[12]。ROS同樣會引起精子細胞膜發生過氧化反應，改變精子形態[13]，另一方面ROS 作用于精子核酸及相關組蛋白，從而破壞精子DNA 完整性[14-15]，引起精子DFI 升高。我們的研究發現中低濃度乙醇對精子DFI 影響較小，這可能是精子本身的自我保護機制在起作用，但是高濃度乙醇可顯著增加精子DNA 損傷和DFI 升高，這可能是乙醇引起精子代謝異常，ROS 增加，進而引起精子DNA 損傷。有研究顯示淋巴細胞DNA 損傷后增加培養環境中的雌激素可促進DNA 損傷的修復，但是精子由于細胞質的丟失，沒有自我修復功能[16-17]，因此我們推測，即使體內環境有雌激素的干擾，當乙醇引起精子DFI 升高后不會因為雌激素的作用而降低，與我們體外實驗的結論一致。

綜上所述，本研究去除了乙醇通過生殖內分泌系統、附屬性腺以及對睪丸的直接損害等因素對精子的影響，觀察到乙醇對體外精子的直接影響，即低濃度乙醇可降低精子活力、正常精子形態，較高濃度可引起DFI 升高。但是，乙醇進入體內后會發生復雜的理化反應，乙醇及其代謝產物對精子的影響及其機制仍需大樣本多中心的深入研究。