miR-142-5p通過直接靶向ELK1調控動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡

羌玲玉 湯小星 孫曉暉

(1南通大學醫學院人體解剖學教研室，江蘇 南通 226019；2南通市中醫院介入科；3南通市老年康復醫院心內科)

研究顯示內皮細胞損傷、氧化應激及炎癥反應等均與動脈粥樣硬化發病機制有關〔1，2〕。因而探尋動脈粥樣硬化內皮細胞損傷機制可為動脈粥樣硬化防治提供新方向。微小RNA(miRNA)作為內源性非編碼RNA分子，其可通過調控基因或信號通路進而參與心腦血管疾病發生及發展過程〔3〕。微小RNA-142-5p(miR-142-5p)在動脈粥樣硬化斑塊中呈高表達并可促進氧化型密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的巨噬細胞凋亡，但關于miR-142-5p在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的具體作用機制尚未完全闡明〔4〕。通過靶基因預測網站發現包含轉錄激活因子ETS樣蛋白(ELK)1可能是miR-142-5p的靶基因，研究顯示miR-150可靶向ELK1而調節ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡〔5〕。相關研究表明ELK1可保護皮質神經元免受缺氧葡萄糖損傷，還可通過調控Wnt/β-catenin信號通路進而影響細胞增殖及遷移過程〔6,7〕。ox-LDL誘導主動脈內皮細胞HAECs中miR-142-5p表達及其是否通過靶向ELK1影響內皮細胞凋亡還有待驗證。本研究通過探討miR-142-5p在ox-LDL誘導的主動脈內皮細胞損傷中的調控作用及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 人主動脈內皮細胞(HAEC)購自美國ATCC細胞庫。ox-LDL購自北京索萊寶科技有限公司。RPMI1640培養基購自上海博升生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)、胰酶均購自美國Gibco公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；熒光素酶檢測試劑盒購自美國Gene Copoeia公司；LipofectamineTM2000、TRIzol均購自美國Invitrogen公司；miR-142-5p mimic及陰性轉染質粒、miR-142-5p抑制劑(anti-miR-142-5p)、anti-miR-NC均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；ELK1 siRNA(si-ELK1)與陰性對照siRNA(si-NC)均購自德國Qiagen公司；實時熒光定量PCR與反轉錄試劑盒均購自北京寶日醫生物技術有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、磷酸化糖原合成酶激酶(pGSK-3β)、總GSK-3β與β-catenin抗體均購自美國CST公司；c-myc抗體購自美國Origene公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗(IgG-HRP)購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染 -80℃超低溫冰箱保存的HAECs經恒溫水浴鍋溶解后，放入含有10%FBS的RPMI1640培養液中培養，離心后(800 r/min)接種于細胞培養瓶，置于恒溫培養箱內培養(37℃、體積分數5%CO2)，0.25%胰酶消化后進行傳代培養。轉染前1 d收集生長良好的HAECs接種于96孔板，待細胞融合至80%左右時進行轉染，應用Lipofectamine2000轉染試劑分別將anti-miR-142-5p、anti-miR-con、pcDNA、pcDNA-ELK1轉染到HAECs中，轉染后6 h更換新鮮培養基，繼續培養48 h收集細胞。

1.2.2ox-LDL處理及分組 用100 μg/ml的ox-LDL刺激HAECs，分別于0、12、24、48 h 時收集細胞〔8〕。收集“1.2.1”中轉染12 h后的HAECs，用100 μg/ml的ox-LDL分別處理HAECs 24 h，實驗將ox-LDL刺激HAECs分為anti-miR-con+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+ox-LDL組、pcDNA+ox-LDL組、pcDNA-ELK1+ox-LDL組。為進一步驗證miR-142-5p與ELK1對ox-LDL刺激HAECs凋亡的影響，在HAECs中共轉染si-ELK1與anti-miR-142-5p，作用12 h后經ox-LDL作用24 h，分別為anti-miR-142-5p+si-con+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+si-ELK1+ox-LDL組。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-142-5p、ELK1 mRNA表達水平 TRIzol法提取各組HAECs總RNA，應用紫外分光光度計檢測RNA濃度，取1 μg RNA進行反轉錄得到cDNA，miR-142-5p、ELK1引物均由美國Invitrogen公司合成，miR-142-5p以U6為內參基因，ELK1以β-actin為內參基因，PCR條件為95℃ 5 min，95℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 1 min(循環40次)，72℃終延伸10 min，根據qRT-PCR儀自帶軟件分析各孔閾值Ct值，采用2-ΔΔCt法分析miR-142-5p、ELK1 mRNA相對表達量。實驗設置3次重復。

1.2.4Western印跡法檢測ELK1及Wnt信號通路相關蛋白表達水平 收集處理后的HAECs，分別加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液以此提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，反應結束后將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂牛奶封閉2 h，分別加入ELK1、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2 及Wnt信號通路相關蛋白一抗(1∶1 000)，孵育過夜后分別加入二抗(1∶5 000)，增強型化學發光試劑(ECL)進行顯影，蛋白均以β-actin為內參，置于凝膠成像分析系統分析蛋白相對表達量。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組HAECs，放入離心機(轉速1 000 r/min)離心10 min，棄上清，分別加入200 μl結合緩沖液，混勻后分別加入5 μl(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育20 min，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗 根據生物學信息網站預測miR-142-5p的靶基因，發現miR-142-5p的靶基因可能是ELK1，分別構建野生型ELK1熒光素酶報告基因載體(WT-ELK1)與突變型ELK1熒光素酶報告基因載體(MUT-ELK1)，將兩種載體分別與miR-142-5p mimic、miR-con混合后共同轉染到HAECs中，繼續培養48 h后收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞后檢測細胞熒光素酶活性。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗，方差分析，χ2檢驗。

2 結 果

2.1ox-LDL處理時間對HAECs凋亡、miR-142-5p和ELK1表達的影響 與0 h組比較，隨著ox-LDL處理時間的延長HAECs凋亡率明顯升高(P<0.05)。HAECs細胞經ox-LDL刺激后miR-142-5p的表達水平與0 h相比明顯升高，而ELK1 mRNA及蛋白表達均明顯降低(均P<0.05)。Western印跡實驗結果顯示HAECs經ox-LDL刺激后 Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達均明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，見表1、圖1、圖2。

表1 ox-LDL不同時間處理HAECs凋亡及相關蛋白表達比較

圖1 流式檢測HAECs凋亡率

圖2 Western印跡檢測ELK1蛋白表達

2.2anti-miR-142-5p抑制ox-LDL處理HAECs凋亡 用miR-142-5p抑制劑(anti-miR-142-5p)轉染HAECs細胞，經ox-LDL處理后采用流式細胞術檢測HAECs凋亡情況，結果顯示anti-miR-142-5p+ox-LDL組HAECs細胞凋亡率顯著低于anti-miR-con+ox-LDL組(P<0.05)，Western印跡檢測結果顯示，與anti-miR-con+ox-LDL組相比，anti-miR-142-5p+ox-LDL組HAECs細胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達明顯降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 anti-miR-142-5p抑制ox-LDL處理HAECs凋亡和抑制凋亡蛋白的表達

2.3miR-142-5p靶向ELK1 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-142-5p與ELK1的靶向關系，結果顯示miR-142-5p mimic與WT-ELK1共轉染后HAECs細胞相對熒光素酶活性相較于miR-con與WT-ELK1共轉染后HAECs細胞相對熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而miR-con、miR-142-5p mimic與MUT-ELK1共轉染后HAECs細胞相對熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見圖4A、表3。為了驗證miR-142-5p與ELK1之間的調控關系，采用Western印跡法分別檢測抑制miR-142-5p表達及miR-142-5p過表達后ELK1蛋白表達變化，結果發現抑制miR-142-5p表達HAECs細胞中ELK1蛋白表達明顯升高(anti-miR-142-5p組：0.72±0.05、anti-miR-con組：0.58±0.09，P<0.05)，miR-142-5p過表達HAECs細胞中ELK1蛋白表達明顯降低(miR-142-5p組：0.32±0.04、miR-con組：0.61±0.06，P<0.05)，見圖4B。

1～2：anti-miR-con+ox-LDL組,anti-miR-142-5p+tox-LDL組圖3 Western印跡檢測HAECs中凋亡相關蛋白表達

A：miR-142-5p靶向ELK1 3′UTR的序列信息；B：miR-142-5p靶向調控ELK1蛋白表達;1～4:miR-con組，miR-142-5p組，anti-miR-con組，anti-miR-142-5p組圖4 miR-142-5p靶向調控ELK1蛋白表達

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4過表達ELK1抑制ox-LDL處理HAECs凋亡 pcDNA-ELK1+ox-LDL組HAECs細胞中ELK1蛋白表達明顯高于pcDNA+ox-LDL組(P<0.05)。pcDNA-ELK1+ox-LDL組HAECs細胞凋亡率明顯低于pcDNA+ox-LDL組(P<0.05)；與pcDNA+ox-LDL組相比，pcDNA-ELK1+ox-LDL組HAECs細胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達明顯下調(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達明顯上調(P<0.05)，見圖5、表5。

表5 過表達ELK1抑制ox-LDL處理HAECs凋亡

2.5沉默ELK1逆轉anti-miR-142-5p對ox-LDL處理HAECs抑制凋亡作用 雙抑制ELK1與miR-142-5p表達后HAECs細胞中ELK1蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與anti-miR-142-5p+si-con+ox-LDL組相比，anti-miR-142-5p+si-ELK1+ox-LDL組HAECs細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低，而Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達水平均顯著升高(均P<0.05)，見表6、圖6。

表6 沉默ELK1逆轉anti-miR-142-5p對ox-LDL處理HAECs抑制凋亡作用

2.6ELK1和miR-142-5p表達對ox-LDL處理HAECs中Wnt信號通路的影響 與anti-miR-con+ox-LDL組相比，anti-miR-142-5p+ox-LDL組HAECs細胞中p-GSK-3β、β-catenin、c-myc蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。進一步分析顯示anti-miR-142-5p與si-ELK1共同轉染后HAECs中p-GSK-3β、β-catenin、c-myc蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，見圖7、表7。

1～2：pcDNA+ox-LDL組,pcDNA-ELK1+ox-LDL組圖5 Western印跡檢測HAECs中ELK1蛋白和凋亡相關蛋白表達

1～4：anti-miR-con+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+si-con+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+si-ELK1+ox-LDL組；圖7同圖6 Western印跡檢測HAECs中ELK1蛋白和凋亡相關蛋白表達

圖7 Western印跡檢測HAECs中Wnt信號通路相關蛋白表達

表7 ELK1和miR-142-5p表達對ox-LDL處理HAECs中Wnt信號通路的影響

3 討 論

動脈粥樣硬化發病機制尚未完全闡明，研究顯示內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化形成的主要因素〔9〕。ox-LDL是引發血管內皮細胞損傷的重要作用因子，其可促使單核細胞轉化形成巨噬細胞進而形成脂質斑塊〔10〕。研究表明miRNA可通過調控靶基因表達進而參與細胞增殖及凋亡等病理過程〔11〕。

miR-142-5p表達異常與腫瘤發生及發展密切相關，研究顯示冠心病患者血清中miR-142-5p表達水平升高并可能參與動脈硬化及斑塊形成過程〔12,13〕。徐測梁等〔14〕研究表明急性冠脈綜合征患者血清中miR-142-5p表達水平升高且與患者心肌炎癥反應及心肌損傷密切相關。李玉東等〔15〕通過構建動脈粥樣硬化大鼠模型發現動脈粥樣硬化組織中miR-142-5p呈高表達并可通過抑制靶基因表達進而促進巨噬細胞凋亡。然而，miR-142-5p對動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡的影響及其可能作用機制仍未可知，本研究結果顯示隨著ox-LDL處理時間的延長HAECs凋亡率明顯升高，miR-142-5p表達上調，而ELK1表達下調，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達明顯升高，而Bcl-2蛋白表達明顯降低，研究顯示Bcl-2作為抗細胞凋亡蛋白可參與氧化應激所致的血管內皮細胞凋亡等過程，Bax可拮抗Bcl-2抗凋亡作用，若Bax同源二聚體增多可促使細胞凋亡，Bcl-2/Bax失衡可促使線粒體釋放Caspase進而引發Caspase級聯反應，最終激活Caspase-3導致細胞凋亡，通過檢測Caspase-3表達可反應細胞凋亡程度〔16〕。說明ox-LDL可能通過促使內皮細胞凋亡進而引發動脈粥樣硬化。本研究結果說明抑制miR-142-5p可通過促進Bcl-2表達，抑制Caspase-3、Bax表達進而抑制內皮細胞凋亡。提示抑制miR-142-5p表達可避免內皮細胞損傷。

ELK1表達下調可通過介導MAPK途徑進-而促進骨髓瘤細胞增殖，Ohguchi等〔17〕、Zeng等〔18〕研究表明慢性心房顫動患者心肌組織中ELK1表達下調。Yan等〔19〕研究表明ELK1表達異常與小鼠動脈粥樣硬化形成有關。本研究結果提示上調ELK1表達可抑制ox-LDL誘導的HAECs凋亡，抑制ELK1可逆轉anti-miR-142-5p對ox-LDL處理HAECs抑制凋亡作用，miR-142-5p可靶向調節ELK1表達進而參與動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡過程。但miR-142-5p又是通過調控哪些相關信號通路而發揮作用，研究顯示Wnt/β-catenin信號通路激活后可通過促使內皮細胞、巨噬細胞等功能發生障礙進而促進動脈粥樣硬化發生及發展〔20〕。細胞處于異常狀態時GSK-3β發生磷酸化形成p-GSK-3β，而p-GSK-3β不能促使β-catenin發生磷酸化而降解，β-catenin大量聚集可從細胞質轉移至細胞核中進而激活c-myc，促使細胞凋亡〔21〕。本研究結果說明抑制miR-142-5p表達可抑制Wnt/β-catenin信號通路活化。miR-142-5p可通過下調ELK1表達而激活Wnt/β-catenin信號通路進而促使內皮細胞凋亡。

綜上所述，miR-142-5p在ox-LDL誘導的HAECs中呈高表達，而ELK1表達降低，miR-142-5p可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路進而促進HAECs凋亡，為進一步研究動脈粥樣硬化發病機制奠定基礎。