低溫發酵酸奶體內和體外抗氧化作用研究

徐廣新，楊仁琴，吳慧,3，周煒，楊忠良，劉陽，印伯星,3

（1.江蘇省乳業生物工程技術研究中心，江蘇揚州225004；2.揚州市揚大康源乳業有限公司，江蘇揚州225004；3.揚州大學，江蘇揚州225009）

0 引 言

隨著人體年齡的增長，機體內氧自由基增多，造成身體系統失衡。過量的自由基會引起脂質過氧化，破壞生物大分子，導致細胞損傷、染色質結構改變、減少或丟失細胞復制能力，最終導致身體衰老和功能障礙，如炎癥、呼吸系統疾病和心血管疾病[1]。其中炎癥性腸病伴有腹瀉、疲勞、上皮組織損傷等癥狀，這極大的影響人們日常生活質量[2]。

酸奶作為牛奶發酵生產的主要乳制品之一，具有預防腹瀉、免疫調節、預防骨質疏松、膽固醇降低和癌癥預防等功能特性[3]。市面上銷售的酸奶產品種類繁多，如原味或調味酸奶、粗酸奶、濃縮酸奶等，但正常酸奶是在42 ℃進行發酵制備得到的[4]。關于酸奶低溫發酵產品的功能特性相關報道較少，因此本研究旨在考察低溫發酵酸奶（27～32 ℃）體外抗氧化活性及對模型小鼠體內炎癥調節作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

生鮮牛乳從揚州大學實驗農牧場獲得；脫脂奶粉采購自新西蘭；商業酸奶發酵劑（ST338-1），含有嗜熱鏈球菌和人源乳桿菌grx07，購自江蘇昊特食品科技有限公司；D-半乳糖（規格10 g），美國Sigma 公司；0.9%生理鹽水，揚州大學第一附屬醫院；SOD、GSH-Px、MDA、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α測定試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。

SD 雄性鼠，50 只，由揚州大學比較醫學中心提供合格證：SCXK（蘇）2007-0001。大鼠飼養及實驗均在本院清潔級實驗動物室內進行。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計（UV-2550），日本島津公司；超聲波清洗機（KH5200E），昆山禾創公司；高壓滅菌鍋（SX－500），日本TOMY 公司；低溫高速離心機（MACH1.6R），美國賽默飛世爾公司；恒溫培養箱（SPX-150BSH-II），上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 酸奶樣品實驗

生鮮乳經 19 MPa 均質、95 ℃ 消毒 5 min 后冷卻至30 ℃（LG）和42 ℃（HG），通過發酵劑（ST338-1）（質量分數0.04%）進行接種發酵，發酵酸度在70 °T 左右，放置于4 ℃貯藏備用。

1.4 體外抗氧化活性

1.4.1 2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）自由基清除活性

1 g 酸奶用95%乙醇稀釋，充分混合后，在440g 下4 ℃離心20 min，分離上清液部分進行進一步分析。100 mol/L DPPH 溶液，在 96 孔板中加入 100 μL 樣品（1∶1 比例）。孵化后用DPPH 陽離子交換樹脂分光光度法測定每種酸奶對DPPH自由基的清除活性-517 nm下的顯色分析[5]。

1.4.2 2,2'-疊氮基-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS+）自由基清除活性

1 g 酸奶用95%乙醇稀釋，充分混合后，在440g 下4 ℃離心20 min，分離上清液部分進行進一步分析。用5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L 過硫酸鉀，在黑暗中孵育12～16 h。ABTS+工作將溶液在95%乙醇中稀釋，以便在734 nm 處達到 0.70±0.02 的OD，并與樣品在1∶1 的條件下混合96 孔板的比率。培養30 min 后，測定每種酸奶對ABTS 自由基的清除活性在734 nm 處通過ABTS+陽離子脫色分析進行分光光度測定[6]。

1.5 動物實驗

1.5.1 動物分組、造模及干預

將50 只小鼠給予標準飼料適應性飼養3 d 后，隨機分成空白組、模型組、低溫發酵酸奶組（LG）、高溫發酵酸奶組（HG），每組10 只。除空白對照組外的4 組采用D-半乳糖致衰老動物模型法造模，每日上午給予小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖（10 mg/mL，100 mg/kg），空白對照組注射同等體積的0.9%生理鹽水，連續30 d[1]。在造模的同時，各組給予相應的干預：空白對照組、衰老模型組灌服蒸餾水(25 mL/kg) ，低溫發酵酸奶組和高溫發酵酸奶組灌服酸奶(25 mL/kg)。

1.5.2 小鼠臟器指數測定

灌胃4 周后，小鼠稱體重，眼球取血，頸椎脫臼處死后摘取脾臟，肝臟和心臟，將周圍組織剝離干凈后稱重。按下公式計算：臟器指數（mg/g）=（肝臟重量/小鼠體重）×100%。

1.5.3 小鼠血清抗氧化因子和細胞因子測定

小鼠血清制備：實驗第56 d對所有小鼠禁食12 h后，于第57 d早上脫臼處死，眼球取血并置于非肝素化PE管中，37℃恒溫孵育30 min后離心10 min（5 000 rpm，4 ℃）分離并收集血清；

SOD 活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA 含量測定采用TBA 法，GSH 和GSH-Px 活性測定參照試劑盒測定。細胞因子IL-4、IL-6、IL-10 和TNF-α的水平采用酶聯免疫吸附試劑盒測定。

1.6 統計學分析

數據采用SPSS19.0 軟件包進行統計學處理，計量資料以“x±s”表示，對于滿足正態分布、方差齊性的指標，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA) ，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 低溫發酵乳體外抗氧化活性

圖1 顯示了在低溫和高溫條件下發酵酸奶的抗氧化活性。HG 組在酸奶樣品濃度為 5、10、15、20、25 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率分別為14.9%±1.33%、25.36%±1.22%、35.95%±1.13%、45.64%±2.10%、55.35%±1.59%，差異有顯著性（P ＜0.05）；ABTS+自由基清除活性分別為21.08%±1.69%、31.08%±2.69%、41.11%±1.69%、50.08%±2.94%和70.23%±2.32%。LG組在酸奶樣品濃度為 5、10、15、20、25 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率分別為32.21%±2.16%、52.00%±1.32%、62.61%±2.45%、72.82%±2.22%、82.23%±2.23%，差異有顯著性（P ＜0.05）；ABTS+自由基清除活性分別為35%±1.69%、55.72%±1.88%、70%±2.46%、85.28%±1.46%、90.77%±1.29%，差異有顯著性（P ＜0.05）。

圖1 不同濃度低溫發酵酸奶與高溫發酵酸奶抗氧化活性

表1 低溫發酵酸奶對小鼠器官系數的影響

清除DPPH 和ABTS+自由基活性的差異是由于樣品在底物中的溶解度和擴散性所致。由于DPPH可溶于有機溶劑，當自由基清除劑為親水性時，它無法完全體現反應樣品的抗氧化活性；而ABTS+在水和有機溶劑中都能很好地溶解，親水性和親脂性抗氧化劑產生的自由基清除作用可以用它來測量[7]。發酵過程中細胞壁成分的水解和釋放導致食品中酚類化合物的釋放，從而影響其抗氧化能力。酸奶的抗氧化活性來自于牛奶成分的水解，特別是4～20 ku 的水解產物在抗氧化效果分析中顯示出顯著的高抗氧化活性，既水解程度越高，抗氧化作用越強[8]。考慮到這一點，低溫發酵酸奶的高抗氧化活性被認為是由于牛奶蛋白質的水解程度高于一般發酵酸奶。

2.2 低溫發酵酸奶對小鼠器官指數的影響

器官指數可以直接反映器官的結構變化，間接反映器官功能的變化。與空白對照組比較，模型組心、肝、腎指數均顯著降低（P＜0.05）。但模型組脾指數較空白組顯著增加（P＜0.05），猜測脾臟可能因免疫反應或炎癥反應而變大，這與Herias 等人研究[9]炎癥小鼠器官指數時結果一致。另外，低溫發酵酸奶和高溫發酵酸奶對小鼠器官指數均有不同程度改善作用，這可能主要由于酸奶中微生物對腸道調節及其代謝產物抗氧化作用造成的。含有益生菌的酸奶，如鼠李糖乳桿菌GG、發酵乳桿菌BR11 和嗜熱鏈球菌TH-4，對改善小鼠抗氧化作用具有功效[10]。

2.3 低溫發酵酸奶對血清中SOD、GSH、GSH-Px 活力和MDA 含量的影響

正常情況下，機體的氧化和抗氧化系統處于動態平衡狀態，機體自身的抗氧化酶如SOD、CAT、GSH-Px 等在清除自由基方面發揮著重要作用。當外界刺激引起氧化應激損傷時，機體代謝紊亂，初始平衡狀態無法維持；脂質過氧化導致機體產生大量的阿莫諾夫過氧化物產物[1]。如表2 所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中丙二醛含量明顯升高（P＜0.05），表明小鼠抗氧化系統失衡。與模型組相比，低溫發酵酸奶和高溫發酵酸奶組可降低小鼠血清中MDA 含量（P＜0.05）。丙二醛（MDA）是體內膜脂過氧化的最終代謝產物，能較好地反映組織過氧化程度。細胞膜上釋放的丙二醛能與蛋白質和核酸發生反應，引起交聯聚合，也能抑制蛋白質的合成，主要是通過破壞膜的結構和功能，改變膜的通透性，從而影響正常生物體的生化反應[11]。

SOD、GSH、GSH-Px 是人體抗氧化系統中的一種重要酶。SOD 能將體內過量的超氧陰離子自由基轉化為過氧化氫，過氧化氫經過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）轉化為過氧化氫，保護機體免受損傷[12]。GSH-Px 與GSH 協同工作，保護機體免受ROS 損傷，維持機體的正常功能[13]。與空白組相比，模型組小鼠血清中SOD、GSH 和GSH-Px、均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，經低溫發酵酸奶和高溫發酵酸奶后，小鼠血清中抗氧化物含量顯著提高，SOD、GSH 和GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05）。

表2 低溫發酵酸奶對血清中SOD、GSH、GSH-Px活力和MDA含量的影響

2.4 低溫發酵酸奶對血清中IL-4、IL-6、IL-10 和TNF-α的影響

D-半乳糖誘導的小鼠衰老不僅導致機體氧化應激損傷，導致免疫功能低下，還分泌TNF-α、IL 等炎性細胞因子，引起肝細胞凋亡和壞死[14]。因此，我們篩選了致炎細胞因子IL-6 和TNF-α，它們能引起免疫紊亂和放大炎癥，以及抗炎細胞因子IL-4 和IL-10。IL-4 和 IL-10 主要由 T 輔助細胞 1 型（Th1）產生，具有調節炎癥的作用；IL-6 可促進炎癥部位急性蛋白和T 細胞的積累，而TNF-α是炎癥過程中最早、最重要的介質，在肝損傷的病理過程中都起著重要作用[15]。

如圖2 所示，與正常組相比，模型組（D-半乳糖誘導）血清中促炎因子TNF-α和IL-6 的表達增加，抗炎因子IL-4 和IL-10 的表達降低。與模型組相比，低溫發酵酸奶和高溫發酵酸奶對TNF-α和IL-6 有下調作用，而對IL-4 和IL-10 有上調作用，從而抑制小鼠體內炎癥因子的表達，達到減緩體內氧化應激損傷，但無顯著性差異。這與Ji-Woo Yoon 等人[16]在研究不同發酵酸奶乳清抗氧化活性的結果是一致的。Sheikhi 等人[17]發現酸奶中益生菌，如乳酸雙歧桿菌BB-12 和嗜酸乳桿菌LA-5 調節潰瘍性結腸炎患者的細胞因子分泌。

3 結 論

對低溫發酵酸奶體內外抗氧化活性進行研究，發現低溫發酵酸奶DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力高于高溫發酵酸奶。在動物實驗中，低溫發酵的酸奶對被測樣品的器官指數和細胞因子水平都有影響，但低溫和高溫酸奶沒有顯著差異。綜上所述，低溫發酵酸奶具有較強的自由基清除作用，對D-半乳糖誘導的衰老小鼠模型具有一定作用，但沒有顯著差異，可能需要進一步研究。

圖2 低溫發酵酸奶對小鼠血清中炎癥因子的影響