超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中乙酰甲喹及其代謝物

馬曉年，陳俊秀，張秀清，李旭

（昆明市疾病預(yù)防控制中心, 昆明650228）

0 引 言

乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)屬于喹噁啉類藥物，該類藥物能顯著促進(jìn)動物生長，且對多數(shù)革蘭氏陽性和陰性病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，因此在養(yǎng)殖中被廣泛使用[1-2]。但是，隨著養(yǎng)殖戶對于該獸藥的濫用,乙酰甲喹在動物體內(nèi)殘留量超標(biāo)導(dǎo)致的中毒事件時有發(fā)生[3]。乙酰甲喹毒性研究表明,其具有低至中度的急性毒性，并且對肝、腎和腎上腺具有損傷,此外還具有遺傳毒性,對動物生殖能力和胎兒有一定抑制作用[4]。因此，建立簡便、靈敏的分析方法十分必要。目前，常見使用液相色譜[5-6]、液質(zhì)聯(lián)用[7-8]等方法檢測水產(chǎn)品[6-7]、飼料[9-10]、禽畜肉[11-15]中乙酰甲喹及其代謝物的殘留，而牛奶中的殘留鮮見報道。牛奶由于豐富的營養(yǎng)成分成為日常生活中必不可少的食品，因其高脂高蛋白的特性，本文著重研究了樣品的前處理，建立了牛奶中乙酰甲喹及其代謝物的UPLC-MS/MS 檢測方法。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

QTRAP 4500 質(zhì)譜分析儀美國 AB SCIEX；Agi-lent 1290 高效液相色譜儀美國安捷倫；高速冷凍離心機(jī)湖南赫西儀器；振蕩器常州金壇恒豐儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國IKA；氮吹儀（Reeko Auto EVA-30）；電子天平（METTLER, 0.01 mg）；均質(zhì)器；Agela Technologies Cleanert PAX 固相萃取小柱（60mg/3mL）；Agela Technologies Cleanert PEP 固相萃取小柱（60mg/3mL）。

液態(tài)牛奶，市購；喹噁啉-2-羧酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度為98.9%）德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；乙酰甲喹（北京，MANHAGE）；甲醇、乙酸乙酯（色譜純），（美國 JT Baker）；甲酸（優(yōu)級純）；氯化鈉（分析純）；正己烷（優(yōu)級純）；實驗用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取喹噁啉-2-羧酸（2-quinoxalinecarboxylic acid，QCA）標(biāo)準(zhǔn)品4.20 mg、乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)品3.30 mg，用甲醇溶解并定容至20 mL 制成母液。再取喹噁啉-2-羧酸、乙酰甲喹各50 μL 定容至50 mL 棕色容量瓶中，喹噁啉-2-羧酸配成質(zhì)量濃度為210 ng/mL，乙酰甲喹配成質(zhì)量濃度為165 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃避光保存。使用時根據(jù)需要配制適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的提取

取10 g（精確至0.01 g）均質(zhì)好的牛奶樣品于50 mL離心管中，加乙酸乙酯20 mL，振蕩15 min，轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min，取乙酸乙酯層于雞心瓶中。再加20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的氯化鈉溶液溶解殘留物，加5 mL 正己烷振蕩混合1 min，靜置分層，棄去正己烷。再加正己烷5 mL，重復(fù)提取1 次，取下層液備用。

1.3.2 樣品的凈化

PAX 及 PEP 小柱依次用 3 mL 甲醇、3 mL 水活化，取備用液分別過PAX 及PEP 固相萃取小柱，用3 mL水淋洗抽干，再用3 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯蹈伞Ｓ?.0 mL 甲醇溶解殘留物，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，供超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定。

1.4 儀器條件

色譜：島津Inertsil ODS-3柱（3 μm，2.1mm×100mm）；流動相A 為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水；流動相B 為乙腈-甲醇（體積比為3∶11），梯度洗脫程序件如表1 所示；流速為0.30 mL/min，分析時間5 min，進(jìn)樣體積5 μL，柱溫30 ℃。

表1 流動相梯度洗脫

質(zhì)譜：離子源為電噴霧離子源（ESI+）;掃描方式為正離子模式；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電離電壓為4.5 kV；檢測方式為多反應(yīng)檢測（MRM）；離子源溫度為450 ℃；噴霧器壓力為3.10×105Pa；輔助加熱氣為3.10×105Pa；氣簾氣壓力：2.41×105Pa；其他參數(shù)如表2所示。

表2 各化合物質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)待測物的性質(zhì)，使用喹噁啉-2-羧酸、乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)儲備液在ESI+模式下分別進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。選擇藥物響應(yīng)強(qiáng)度最高的m/z 值作為母離子，進(jìn)行子離子掃描，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓。并在MRM 模式下優(yōu)化了氣簾氣、離子源溫度、噴霧氣、輔助加熱氣。

2.2 色譜條件優(yōu)化

本文采用ESI+模式，故水相選用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水。有機(jī)相實驗了甲醇、乙腈及兩相混合的效果，單一使用甲醇為有機(jī)相時，峰形展寬、拖尾，單一使用乙腈為有機(jī)相時，基線噪音增大。綜合考慮，選擇甲醇-乙腈混合作為有機(jī)相并實驗了不同比例對實驗結(jié)果的影響，最終確定(3∶11)乙腈/甲醇-0.1%甲酸水為流動相。圖1 為喹噁啉-2-羧酸及乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM 譜。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM譜

2.3 提取溶劑的選擇

本研究重點(diǎn)對比了不同提取溶劑，包括乙酸乙

酯、乙腈-乙酸乙酯（1∶9）、乙腈-乙酸乙酯（2∶8）、乙腈-乙酸乙酯（5∶5）等對藥物的提取效果。實驗發(fā)現(xiàn)，乙腈-乙酸乙酯（1∶9）、乙腈-乙酸乙酯（2∶8）分層效果不理想，震搖乳化。乙腈-乙酸乙酯（5∶5）提取，分層效果較好（分為乙腈層、磷脂層、乙酸乙酯層）。乙酸乙酯、乙腈混合對喹噁啉-2-羧酸的回收率差別不大，而乙酸乙酯對脂溶性較大的乙酰甲喹有較好的提取效率，能達(dá)到50%以上。采用乙酸乙酯提取雜質(zhì)較少，提取效率較好，且毒性低，容易揮干，本方法最終選擇了乙酸乙酯為提取溶劑，并采用正己烷脫脂后再用小柱凈化。

2.4 固相萃取小柱的選擇

本文進(jìn)行了3 個水平的加標(biāo)回收實驗，比較了PAX 及PEP 兩種固相萃取小柱對喹噁啉-2-羧酸及乙酰甲喹的保留能力。結(jié)果表明PAX 固相萃取小柱對兩種待測物的回收率均較好，而喹噁啉-2-羧酸過PEP 固相萃取小柱后峰有分裂。實驗結(jié)果如表3 和表4 所示，故實驗最終選擇PAX 固相萃取小柱進(jìn)行樣品凈化。圖2 為兩種標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過PAX 及PEP 固相萃取小柱凈化的MRM 譜圖。

表3 喹噁啉-2-羧酸經(jīng)固相萃取柱凈化后回收率

表4 乙酰甲喹經(jīng)固相萃取柱凈化后回收率

2.5 方法研究及結(jié)果分析

2.5.1 線性范圍、回歸方程和檢出限

圖2 標(biāo)準(zhǔn)過小柱凈化MRM譜

表5 目標(biāo)物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限

表6 喹噁啉-2-羧酸加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

表7 乙酰甲喹加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

圖3 加標(biāo)樣品MRM譜

配制含喹噁啉-2-羧酸的質(zhì)量濃度為4.2，12.6，21.0，42.0，126.0 ng/mL；乙酰甲喹的質(zhì)量濃度為3.3，9.9，16.5，33.0，99.0，165.0 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)組分的峰面積（y）對質(zhì)量濃度（X）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。兩種化合物的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限如表5所示。

2.5.2 方法的精密度及準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確稱取空白樣品 18 份，每份 10.00 g，分 2 組，每組分為三個水平，各添加4.2，10.5，21.0 ng 喹噁啉-2-羧酸和3.3，8.25，16.5 ng 乙酰甲喹。按供試品溶液制備方法制備后兩組樣品分別過PAX 及PEP 固相萃取小柱進(jìn)行測定，結(jié)果如表6 和表7 所示。由表6 和表7可以看出，兩種組分過PEP 固相萃取小柱回收率，在低濃度均高于150%，高濃度結(jié)均低于50%。而兩組分過PAX 固相萃取小柱，不同濃度的平均加標(biāo)回收率在50.5%～117%之間，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.4%～8.9%。結(jié)合上述固相萃取小柱回收試驗，說明PAX 固相萃取小柱有更良好的準(zhǔn)確性，適宜于牛奶中喹噁啉-2-羧及乙酰甲喹殘留的測定。圖3 為標(biāo)準(zhǔn)品及加標(biāo)樣品中MRM 色譜圖。

3 結(jié) 論

本研究建立了測定牛奶中乙酰甲喹及代謝物的超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用測定方法，該方法操作簡單、靈敏、穩(wěn)定。通過對樣品前處理的研究，PAX 固相萃取小柱凈化可以有效去除雜質(zhì)，降低干擾，準(zhǔn)確度及精密度都較高，可用于牛奶中乙酰甲喹及喹噁啉-2-羧酸的定性、定量測定。