響應面法優化酸棗仁苦蕎酸奶發酵工藝

李華，倪娜，趙汝，王華

（內蒙古民族大學，內蒙古通遼028000）

0 引 言

酸棗仁，是鼠李科植物酸棗經干燥后的成熟種子，富含油性物質氣味微淡[1-2]。近年很多學者研究認為黃酮類物質是酸棗仁中重要的活性物質之一，其具有抗氧化、鎮靜催眠等多種功效[3-4]。 苦蕎，蓼科作物，苦蕎中含有豐富的黃酮類等化合物，使它不僅可以降血糖、降血脂，同時還具有清除自由基、抗菌、抗癌等功效[5-8]。

本研究對酸棗仁、苦蕎進行預處理后將其用于酸奶發酵中，使產品除具有酸奶本身維持腸道菌群健康、提高免疫力等保健功能外，還具有清除自由基、抗氧化等保健功能，以迎合現代消費者對風味、營養及保健功能完美結合的需求。此外，產品的研發也體現了藥食同源資源在食品中的綜合利用，同時為酸奶產品多樣化及功能性酸奶市場的擴大提供理論基礎。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

酸棗仁（生），市售；苦蕎，市售；牛奶，市售；蔗糖，市售；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus Bugarska）、嗜熱鏈球菌（Termofilski Streptococcus）為內蒙古民族大學食品科學與工程實驗室提供。

乙醇（95%），磷酸（98%），無水乙醇，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁均為AR，天津市大茂化學試劑廠；蘆丁，南京奧多福尼生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250，天津市天力化學試劑有限公司；牛血清白蛋白，BSA Bovine Serum；總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)，Beyotime。

1.2 儀器設備

高速多功能搖擺粉碎機（XTP-500A），浙江永康市紅太陽機電有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9203A），上海精宏實驗設備有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5500PC），上海元析儀器有限公司；恒溫培養箱（DNP-9272），上海精宏實驗設備有限公司；高速臺式冷凍離心機（TGL-16M），長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.3 工藝流程

1.3 操作要點

1.3.1 酸棗仁苦蕎漿的制備

用高速粉碎機將酸棗仁進行粉碎后過60 目篩，與水按1∶7 混合后煎煮1.5 h，冷卻后過濾，濾液備用。苦蕎發芽后以嫩莖、嫩葉為原料，經干燥、粉碎后過60目篩，與水按1∶5 混合后糊化酶解得苦蕎漿。根據前期預實驗的結果將二者以2∶1 的比例混合均勻，4 ℃貯藏備用。

1.3.2 菌種馴化

將均質后的鮮牛奶冷卻至42 ℃左右，按照鮮牛奶∶乳酸菌（Lactobncillus bulgaricus∶Streptococcus thermophilus=1∶1)的接菌量為150 mL∶1 g的比例添加乳酸菌，置恒溫培養箱內42 ℃，發酵7 h后4 ℃ 冷藏，留以備用[9]。

1.3.3 配料混勻

將均質后的牛奶和酸棗仁苦蕎漿混合均勻，按比例加入白砂糖，冷卻溫度至42 ℃左右接馴化后的菌種，充分攪拌。

1.4 酸棗仁苦蕎酸奶感官評定

根據GB19302-2010（食品安全國家標準發酵乳）[10]設計酸棗仁苦蕎酸奶的感官評分標準（百分計）如表1 所示。由15 名人員（無感冒，身體狀態良好，無不良嗜好）組成感官評定小組，將適量的酸奶盛裝于容器中，在光線充足的環境下觀察酸棗仁苦蕎酸奶顏色，聞酸奶的氣味，然后用純凈水多次漱口，最后品嘗滋味，根據表1 對編號的樣品進行感官評分，求其平均值作為最終得分并記錄。

1.5 酸棗仁苦蕎酸奶中黃酮質量分數的測定

根據食品中總黃酮的測定分光光度法（SZDB/Z 349-2019）[11]配制標準溶液與樣品，使用分光光度計（波長λ為510 nm），分別測定標準溶液與樣品的吸光度值A，以黃酮濃度為橫坐標，以吸光度A 為縱坐標制作黃酮標準工作曲線，并得到回歸方程，代入黃酮計算式（1）計算得出酸棗仁苦蕎酸奶中黃酮質量分數，即

式中：ω為黃酮質量分數（mg/100g）；m1為根據標準曲線得到的黃酮質量（mg）；V 為試樣的提取體積（mL）；V1為吸取試樣的體積（mL）；M 為試樣的質量（g）。

1.6 產品理化及微生物指標測定方法

酸度的測定按GB5009.239-2016 中的酸度滴定法執行[12]；

蛋白質的測定按GB 5009.5-2010 中的凱氏定氮法執行[13]；

脂肪的測定按GB 5413.3-2010 中蓋勃氏法測定脂肪含量[14]。

同時采用試劑盒測定產品的總抗氧化活性，并以市售普通酸奶做比較。

1.7 酸棗仁苦蕎酸奶單因素發酵工藝優化

本研究對影響酸棗仁苦蕎酸奶品質的4 個發酵工藝參數白砂糖添加量、乳酸菌接菌量、酸棗仁苦蕎漿添加量及發酵時間分別進行單因素試驗變量研究。分別考察白砂糖添加量（7%，8%，9%，10%，11%）；乳酸菌接菌量（2%，3%，4%，5%，6%）；酸棗仁苦蕎漿添加量（10%，15%，20%，25%，30%）和發酵時間（5，6，7，8，9 h）對酸棗仁苦蕎酸奶品質的影響，并經感官評定以確定各單因素的最佳參數。

1.8 響應面法優化酸棗仁苦蕎酸奶發酵工藝

根據Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上采用四因素三水平的響應面分析方法分別分析酸棗仁苦蕎酸奶發酵工藝條件與產品感官品質之間的關系，試驗設計因素及水平如表2所示。

表1 酸棗仁苦蕎酸奶評分標準

表2 發酵工藝條件優化響應面實驗設計

2 結果與分析

2.1 白砂糖不同添加量對產品感官品質的影響

白砂糖在酸奶中即可以影響酸奶的甜度調節改善酸奶風味同時也影響乳酸菌的發酵，適宜的添加量可以促進乳酸菌的發酵，添加量過高或過低都會抑制乳酸菌的發酵[15-16]。取適量均質后的牛奶，添加4%馴化后的乳酸菌接菌和15%的酸棗仁苦蕎漿，再分別以7%，8%，9%，10%，11%的添加量添加白砂糖，混合均勻經42 ℃發酵7 h 后4 ℃后熟得產品，并對產品進行感官評價，其結果如圖1所示。

圖1 白砂糖添加量對酸棗仁苦蕎酸奶品質的影響

由圖1 可以看出，當白砂糖添加量由6%到10%時，感官評分值先增大后減小的趨勢，當白砂糖的添加量為9%時，感官評分值最高可達84.8，酸度為72.2 °T，此時口感柔和細膩，酸甜適中，故白砂糖的最佳添加量為9%。

2.2 酸棗仁苦蕎漿不同添加量對產品感官品質的影響

添加4%馴化后的乳酸菌和質量分數9%的白砂糖，再分別以質量分數10%，15%，20%，25%，30%的添加量添加酸棗仁苦蕎漿，混合均勻經42 ℃發酵7 h 后4 ℃后熟得產品，并對產品進行感官評價，其結果如圖2所示。

圖2 酸棗仁苦蕎漿添加量對酸棗仁苦蕎酸奶品質的影響

由圖2 可知，預處理后的酸棗仁苦蕎漿的顏色為藕荷色，酸棗仁苦蕎漿的添加量在10%～25%范圍時會影響酸奶的風味和色澤。酸棗仁苦蕎漿的添加量較少時，酸奶會呈現其本身的顏色，且產品只有奶香而不具有酸棗仁的典型芳香氣味和苦蕎的麥香；酸棗仁苦蕎漿添加較高時，會抑制乳酸菌的發酵，使發酵時間延長，且酸奶顏色較深且酸棗仁的味道完全掩蓋了酸奶本身的風味。因此，當添加酸棗仁苦蕎漿的量在20%時感官評分最高，可達85.5 分，牛奶酸度76°T，此時酸奶呈現出淡藕荷色，有奶香、酸棗仁的芳香和苦蕎的麥香，口感細膩，酸甜較適口，無乳清析出。

2.3 乳酸菌不同接菌量對產品感官品質的影響

酸奶發酵生產中，嗜熱鏈球菌（Termofilski Streptococcus）有利于提高酸奶酸度，縮短發酵時間；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus Bugarska）發酵產物影響酸奶的風味[17]。在發酵過程中黃酮可能會影響乳酸菌的發酵，在發酵初期黃酮溶出速度較快，為避免黃酮類物質對乳酸菌發酵的影響故本試驗將二種菌種以1∶1 比例進行復合[18-19]。復合菌種接菌量較大或較小對酸奶發酵及產品感官都是非常不利的，接菌量較大會導致酸奶發酵速度過快，產酸較多，酸甜感不協調，且后熟過程中乳清析出較多；接菌量太少，酸奶發酵時間較長，產酸不足的同時也會使酸奶產生異味。取適量均質后的牛奶添加9%白砂糖和20%酸棗仁苦蕎漿，分別以2%、3%、4%、5%、6%的接菌量接菌，混合均勻經42 ℃發酵7 h 后4 ℃后熟得產品，并對產品進行感官評價，其結果如圖3所示。

圖3 乳酸菌接菌量對酸棗仁苦蕎酸奶品質的影響

由圖3 可知，當接菌量在2%～6%時，感官評分呈現先增大后減小的變化趨勢，與此同時隨著接菌量的增大酸奶酸度呈增大的趨勢。綜合感官評分和酸度，確定酸棗仁苦蕎酸奶的乳酸菌最佳接菌量為4%，此時感官評分為87.2 分，酸度為78 °T，產品組織細膩呈淡藕荷色，具有奶香、酸棗仁的芳香和苦蕎的麥香，口感酸甜適中，且無乳清析出。

2.4 不同發酵時間對產品感官品質的影響

酸奶發酵時間的長短會影響發酵過程中各類生物化學反應的發生程度進而影響產品的感官品質。取適量均質后的牛奶添加9%白砂糖和20%酸棗仁苦蕎漿，以4%接菌量接菌，混合均勻經42 ℃分別發酵5，6，7，8，9 h 后4 ℃后熟得產品，并對產品進行感官評價，其結果如圖4所示。

圖4 發酵時間對酸棗仁苦蕎酸奶品質的影響

由圖4 可知，感官評分會隨發酵時間的延長呈現先升高后降低的變化趨勢。發酵時間在5～7 h 時，隨發酵時間延長發酵越充分，質地就越均勻，口感細膩柔和，當發酵7 h 時感官評分最高可達90.7 分，酸度為80 °T；當發酵時間大于7 h 后，酸奶的口感就會有所下降，口感較為細膩，酸度大于80 °T，此時酸奶口感較酸，且隨發酵時間的延長酸度越來越大，酸甜比例失調。因此當發酵7 h 時，酸棗仁苦蕎酸奶質地均勻，潤滑爽口，酸甜感最佳，具有獨特的酸棗仁芳香和苦蕎的麥香。

2.5 響應面法優化酸棗仁苦蕎酸奶發酵工藝

2.5.1 優化發酵工藝的響應面試驗及方差分析

通過Design-Expert8.0 軟件進行表2 二次響應面回歸分析，得到如下多元二次響應面回歸模型：

Y=-718.34167 + 84.82A + 61.52B + 11.014C +47.62667D-1.875AB-0.34AC-0.85AD+0.31BC+0.425BD+0.02CD-3.51917A2-5.93167B2-0.20827 C2-2.96917D2。

由表 4 可以看出：B，C，A2，B2，C2，D2對酸棗仁苦蕎酸奶感官品質的影響極顯著，A 和、AB 對酸棗仁苦蕎酸奶感官品質有顯著影響，影響酸棗仁苦蕎酸奶感官品質的因素先后順序為接菌量＞酸棗仁苦蕎漿添加量＞白砂糖添加量＞發酵時間。總體分析，回歸模型P＜0.001，表明該模型極顯著；同時，回歸模型的失擬項不顯著（P＞0.05），R2Adj= 95.21 %，說明95.21%的數據都可以用這個二次方程解釋。

2.5.2 兩因素交互作用影響發酵工藝的響應面分析

做出響應曲面，分析白砂糖添加量（A），接菌量（B），酸棗仁苦蕎漿添加量（C）和發酵時間（D）對酸棗仁苦蕎酸奶感官品質的影響，結果如圖5 所示。

響應面圖可以評價白砂糖添加量、接菌量、酸棗仁苦蕎漿添加量和發酵時間之間的交互作用及對酸棗仁苦蕎酸奶感官品質的影響，由響應面圖可知曲面有極大值，工藝的最優配方在實驗范圍內，等高線圖近似于橢圓形，說明各因不交互作用較為顯著，這與表4顯著性分析結果一致。

2.5.3 驗證實驗

以酸棗仁苦蕎酸奶的感官品質評分為最終優化值，經Design-Expert8.0 軟件預測可得最佳發酵工藝為：白砂糖添加量8%，接菌量5%，酸棗仁苦蕎漿添加量20%，42 ℃下發酵7 h 后4 ℃下冷藏后熟，產品感官評分預測值為92.4 分。為了檢驗回歸模型預測的可靠性，在預測條件下重復3 次實驗，得到產品的平均感官評分為92.8 分，測定值與預測值之間的相對誤差為0.4%，與預測值基本一致。此時產品呈淡藕荷色，質地均勻，口感細膩，無乳清析出，有酸乳的香氣、酸棗仁的芳香及苦蕎的麥香。

表3 優化發酵工藝Box-Behnken響應面實驗設計與結果

圖5 白砂糖添加量、接菌量及交互作用對感官評分的響應面和等高線

表4 發酵工藝優化方差分析

圖6 白砂糖添加量、酸棗仁苦蕎漿添加量及交互作用對感官評分的響應面和等高線

對產品理化性質及黃酮含量進行了測定，參考國標GB19302-2010《食品安全國家標準發酵乳》的各項指標進行評定，結果如表5所示。由表5可以得出，酸棗仁苦蕎酸奶各項理化指標均符合國標，且產品中由于添加了藥食同源的酸棗仁、蕎麥漿而含有黃酮（6.89±0.02）mg/100g，總抗氧化能力（1.019±0.002）mmol/g。

圖7 白砂糖添加量、發酵時間及交互作用對感官評分的響應面和等高線

圖8 接菌量、酸棗仁苦蕎漿添加量及交互作用對感官評分的響應面和等高線

3 結 論

圖9 接菌量、發酵時間及交互作用對感官評分的響應面和等高線

圖10 酸棗仁苦蕎漿添加量、發酵時間及交互作用對感官評分的響應面和等高線

表5 理化指標及黃酮質量分數測定

本文通過Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，在單因素實驗基礎上采用四因素三水平的響應面分析方法分別分析酸棗仁苦蕎酸奶發酵工藝條件與產品感官品質之間的關系，確定酸棗仁苦蕎酸奶的最佳發酵工藝為：白砂糖添加量8%，接菌量5%，酸棗仁苦蕎漿添加量20%，42 ℃下發酵7 h 后4 ℃下冷藏后熟得到的產品呈淡藕荷色，質地均勻，口感細膩，乳清析出少，有酸乳的香氣及酸棗仁的芳香。經測定，酸乳各項理化指標符合GB19302-2010《食品安全國家標準發酵乳》的各項指標，且黃酮質量分數為（6.89±0.02）mg/100g，抗氧化能力（1.019 ± 0.002）mmol/g，說明酸棗仁及苦蕎中的黃酮部分保留在了發酵酸乳中。這為藥食兩用作物酸棗仁及苦蕎在保健食品中的進一步開發應用提供借鑒。