百香果黃酮提取工藝優化及其抗氧化活性研究

李欣燃,張華興,翁貴英,王緒英

(六盤水師范學院生物科學與技術學院,貴州六盤水 553000)

百香果(Passifloraedulis),又名土羅漢果、雞蛋果及洋石榴等,始載于《廣州植物志》,屬于西番蓮科西番蓮屬植物,因其具有數十種水果香味,因而被稱為“百香果”[1-2]。其水份含量豐富,味酸甜可口,不僅可以用來鮮食,還被用來作為果汁[3]、果酒[4]及果醬[5]的原料,深受人們喜愛。現代研究發現,百香果及其果皮具有控制血糖[6-7]、抗高血壓[8-9]、抗炎減脂[10]、護肝保腎[11]和調節心臟自主神經功能[12]等多種生物學功能,且已有研究將百香果皮粉加入面粉[13]或漢堡包[14]中作為食品原料,可以說百香果具有較高的營養價值和藥用價值,有著較大的開發潛力。

黃酮類化合物是植物體內重要的次級代謝產物,是植物發揮多種生物學活性的物質基礎,對人體健康起到重要作用[15-16]。已有研究表明,百香果果肉及果皮中含有黃酮類化合物,并且是其發揮多種生物活性的物質基礎[17-18]。百香果保鮮時常較短,在自然條件下,果實成熟5 d后即開始腐敗[19];而對于果皮,在百香果食用或加工過程中多數被作為廢棄物扔掉,因此,百香果果肉及果皮的進一步開發,尤其是對其中黃酮化合物做進一步的開發研究,對百香果資源的節約以及合理利用具有重要意義,然而目前對于百香果黃酮化合物的研究相對較少,對于百香果果汁的黃酮提取工藝研究不多。

本研究通過響應面法對百香果果肉及果皮黃酮的提取工藝進行優化,進而對提取的黃酮類化合物抗氧化活性進行初步評價,以期為百香果黃酮的提取提供參考數據，為百香果資源進一步的合理開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百香果 購于六盤水市沃爾瑪超市,經六盤水師范學院生物科學與技術學院植物科學教研室鑒定為紫色百香果(PassifloraedulisSims var.edulis);蘆丁標準品(純度﹥98%) 北京中科質檢生物科技有限公司;L-抗壞血酸(USP級別) 生工生物工程(上海)股份有限公司;H2O2(30%)、鹽酸、乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 國產分析純。

BGZ-30電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;UV-2100型紫外可見分光光度計 北京東西分析儀器有限公司;HYF-P0107便攜式攪拌機 海爾集團公司;SB-800DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;DFT-200手提式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;TD5自動脫帽離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;ATY124電子分析天平 沈陽龍騰電子標量儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線建立 取1 mg/mL蘆丁標準品0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL容量瓶中,分別加入5% NaNO20.7 mL,混勻放置6 min,分別加10% Al(NO)30.7 mL,混勻放置6 min,分別加1 mol/L NaOH 10 mL后,再加乙醇補齊至25 mL,混勻放置15 min后,在波長510 nm處分別測量其吸光度。并繪制線性回歸方程:y=11.09x+0.002(R2=0.995)。

1.2.2 原料處理 取果皮自然晾干3 d,40 ℃恒溫烘箱烘至恒重,粉碎后過40目篩待用;取果肉于榨汁機進一步攪拌細碎待用,取磨碎的1 mL果肉樣品稱重三次,平均值為1.016 g,為方便后續試驗,按1 mL=1 g計算。

1.2.3 單因素實驗 將果肉分別按照以下三個因素進行實驗,料液比1∶2、1∶6、1∶10、1∶14、1∶18、1∶22 g/mL,超聲時間50 min,乙醇體積分數70%;提取時間20、30、40、50、60、70 min,料液比1∶6 g/mL,乙醇體積分數70%;乙醇體積分數40%、50%、60%、70%、80%、90%,料液比1∶6 g/mL,超聲時間50 min。

將果皮分別按照以下三個因素進行實驗,料液比1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90 g/mL,超聲時間40 min,乙醇體積分數70%;超聲時間20、30、40、50、60、70 min,料液比1∶50 g/mL,乙醇體積分數70%;乙醇體積分數40%、50%、60%、70%、80%、90%,料液比1∶50 g/mL,超聲時間40 min。以上所有試驗保持超聲功率800 W,超聲溫度50 ℃不變。

黃酮得率計算方法為:黃酮得率(%)=提取液中黃酮含量/百香果果肉或果皮質量×100

1.2.4 響應面優化試驗 根據1.2.3單因素實驗結果,分別以果肉和果皮黃酮得率為響應值,選取表1和表2中的因素為自變量,利用Design-Expret 8.0.6軟件分別對果肉和果皮進行曲面響應試驗,探索百香果肉和果皮黃酮提取的最優條件。

表1 果肉響應面因素水平設計

表2 果皮響應面因素水平設計

1.2.5 抗氧化試驗 將百香果果肉和果皮的黃酮提取物濃縮干燥,并梯度稀釋成濃度為0.182、0.228、0.285、0.356、0.445、0.557 mg/mL黃酮待測物,分別對果肉和果皮黃酮待測物進行羥自由基清除率測定[20-21]及超氧自由基清除率測定[22-23]。

計算方法分別為:羥自由基清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100

式中:Ax為樣品檢測的吸光度;A0為不加樣品時的吸光度;Ax0為不加顯色劑H2O2的吸光度。

超氧自由基清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100

式中:Ax為樣品檢測的吸光度;A0為不加樣品時的吸光度;Ax0為不加鄰苯三酚時的吸光度。

1.3 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件和Microsoft Excel 2007進行試驗設計、數據處理及繪圖,以上數據均為3次平行試驗均值。

2 結果與分析

2.1 百香果果肉及果皮的單因素實驗

由圖1可知,果肉的黃酮得率在料液比為1∶6 g/mL時達到最大,果皮的黃酮得率在料液比為1∶50 g/mL時達到最大(圖2),說明此時二者的黃酮析出量基本已經達到平衡,隨著料液比的進一步增加,黃酮得率略有下降,可能由于不同料液比導致溶劑中黃酮濃度差不同,從而影響提取效率[24],考慮到溶劑成本,分別選擇在1∶6、1∶50 g/mL左右進行優化試驗;果肉(圖3)和果皮(圖4)黃酮得率分別在超聲時間50和40 min時達到最大,隨著時間的延長,黃酮得率略有下降,分析產生的原因可能是隨著時間的延長,黃酮類物質可能部分被氧化,且溶劑中的一些熱敏組分被破壞[25];果肉(圖5)和果皮(圖6)的黃酮得率均在乙醇體積分數為70%時達到最大,可能是此濃度溶劑與百香果黃酮極性最接近,析出量較大,當濃度高于70%時,極性差異增多,同時會引起醇溶性等其他物質的析出,從而間接影響黃酮得率[25]。

圖1 料液比對百香果果肉黃酮得率的影響

圖2 料液比對百香果果皮黃酮得率的影響

圖3 提取時間對百香果果肉黃酮得率的影響

圖4 提取時間對百香果果皮黃酮得率的影響

圖5 乙醇體積分數對百香果果肉黃酮得率的影響

圖6 乙醇體積分數對百香果果皮黃酮得率的影響

2.2 果肉響應法優化工藝

由表3可知,以百香果果肉黃酮類化合物得率為響應值,根據Box-Behnken原理設計三因素三水平試驗,得到果肉黃酮類化合物擬合回歸方程R=-5.22556+0.070062A+0.20463B+0.021825C+8.75000×10-4AB-5.00000×10-4AC-2.50000×10-5BC-4.95312×10-3A2-2.06750×10-3B2-1.17500×10-4C2。其中R為果肉黃酮類化合物得率、A為料液比、B為提取時間、C為乙醇體積分數。

表3 果肉 Box-Behnken試驗設計與結果

根據上述數據得到各項系數的方差分析結果見表4,該回歸模型P<0.0001差異極顯著,失擬誤差P=0.8325,沒有顯著性差異,表明該回歸模型與真實值擬合度較高,其中A、A2和B2為差異極顯著(P<0.01),AB為差異顯著(P<0.05),三個因素對百香果果肉黃酮得率的影響大小依次為A>B>C。

表4 果肉響應面試驗結果方差分析表

由圖7可知,AB交互作用的響應面坡度較陡峭,說明其對百香果果肉黃酮得率具有較顯著的影響,AC和BC交互作用的響應面坡度較平緩,說明二者對果肉黃酮得率影響較小。

圖7 各因素交互作用對從果肉提取黃酮得率影響的響應面

2.3 果皮響應法優化工藝

由表5可知,以百香果果皮黃酮類化合物得率為響應值,根據Box-Behnken原理設計三因素三水平試驗,得到果皮黃酮類化合物擬合回歸方程R=-17.79625+0.058750A+0.23212B+0.40936C+2.02500×10-3AB-1.25000×10-4AC-8.50000×10-4BC-1.40000×10-3A2-4.77500×10-3B2-3.12500×10-3C2。其中R為果皮黃酮類化合物得率、A為料液比、B為提取時間、C為乙醇體積分數。

表5 果皮Box-Behnken試驗設計與結果

圖8 各因素交互作用對從果皮提取黃酮得率影響的響應面

根據表5數據得到各項系數的方差分析結果見表6,該回歸模型P<0.0001差異極顯著,失擬誤差P=0.6218,無顯著性差異,表明該回歸模型與真實值擬合度較高,其中A、B、AB、BC、A2、B2和C2均為差異極顯著(P<0.01),三個因素對百香果果肉黃酮得率的影響大小依次為B>A>C。

表6 果皮響應面試驗結果方差分析表

由圖8可知,AB交互作用的響應面坡度陡峭,說明二者對百香果果皮黃酮得率具有顯著的影響,BC、AC交互作用的響應面坡度較平緩,說明其對果皮黃酮得率影響較小。

2.4 驗證試驗

根據響應面優化結果2.2得到果肉黃酮提取的最優條件為料液比1∶8 g/mL,超聲時間50.75 min,乙醇體積分數70.44%時,果肉黃酮得率為1.02%,為方便試驗操作,將其提取條件優化為料液比1∶8 g/mL,超聲時間51 min,乙醇體積分數70%,進行三次平行試驗,得到百香果果肉黃酮平均提取率為1.04%,其與預測值的相對標準偏差為1.96%。

根據響應面優化結果2.3得到果皮黃酮提取的最優條件為料液比1∶47.18 g/mL,超聲時間40.55 min,乙醇體積分數70.11%時,果皮黃酮得率為2.66%,為方便試驗操作,將其提取條件優化為料液比1∶47 g/mL,超聲時間41 min,乙醇體積分數70%,進行三次平行試驗,得到百香果果皮黃酮平均提取率為2.71%,其與預測值的相對標準偏差為1.88%。

由此說明以上結果可見該方法可靠,結果準確。

2.5 百香果果肉和果皮黃酮提取物體外抗氧化活性檢測

由圖9～圖10可知,在質量濃度0.182～0.557 mg/mL范圍內,百香果果肉和果皮的黃酮類化合物的抗氧化能力與VC的變化趨勢基本一致,當果肉和果皮黃酮類化合物的濃度達到0.285 mg/mL時,其羥自由基的清除率分別達到51%和55%,超氧負離子的清除率分別到達51%和58%。

圖9 不同濃度果肉、果皮黃酮提取物及抗壞血酸對羥自由基清除率

圖10 不同濃度果肉、果皮黃酮提取物及抗壞血酸對羥自由基清除率

3 結論

本試驗以百香果的果肉與果皮為研究對象,采用超聲輔助的提取方案,通過響應面法對總黃酮的提取工藝進行優化。對于果肉的最佳工藝為:料液比1∶8 g/mL,超聲時間51 min,乙醇體積分數70%;對于果皮的最佳工藝為:料液比1∶47 g/mL,超聲時間41 min,乙醇體積分數70%。在各自最優提取條件下,黃酮提取物的得率分別為1.04%和2.71%。體外抗氧化活性試驗的結果表明,果肉和果皮各自的黃酮提取物濃度達到0.285 mg/mL時,各自對羥自由基的清除率分別達到51%和55%,超氧負離子的清除率分別到達51%和58%,說明百香果果肉和果皮具有較好的抗氧化活性。所得的試驗結果可為百香果的進一步開發利用提供一定的理論參考。