葛根多糖純化工藝及其抗氧化性能研究

朱家慶,唐婷范,劉新梅,田玉紅,黃芳麗,程 昊,李曉慧,李榮彬,梁杰婷

(廣西科技大學生物與化學工程學院,廣西糖資源綠色加工重點實驗室,廣西柳州 545006)

葛根(Puerarialobata)別名葛藤,葛麻葉,粉葛藤等[1],產自安徽、廣西、湖北、湖南、云南等地[2],葛根具有降血脂、降血糖、降血壓[3],抗氧化自由基[4-5],預防骨質疏松的作用[6-7]。多糖是高分子聚合而成的碳水化合物,具有很好的生物活性及藥理作用[8-11],安全無毒。董洲等[12]在野葛根中分離純化出新型酸性多糖,鑒定了該多糖的結構特征可用于免疫調節活性,也證明了葛根里含有多糖類化合物。陳兵兵[13]對葛根多糖進行逐級分離,通過體外抗氧化研究發現,葛根多糖具有較好的等價抗氧化能力。但原生態葛根中非多糖類物質和多糖結合成復合物,使多糖的利用率隨之下降,葛根多糖作為有益的天然產物不利用起來又會導致資源的浪費,所以對葛根多糖的分離純化是一個亟待解決的難題。

近年來,隨著國內外對多糖的純化工藝深入研究[14-16],到目前多糖的分離純化方法有很多,Chen等[17]采用ASE技術快速分離提取多糖,Nie等[18]采用陰離子交換色譜法純化生菜多糖,這些方法操作復雜,成本高,吸附速度慢,選擇性差,難以實現大規模生產。與此同時,大孔樹脂純化法具有吸附容量大、有效成分損失少、成本低、雜質去除率高等優點,常用于多糖的分離純化。陳琛等[19]利用大孔樹脂法對天麻多糖進行純化工藝研究,實驗表明大孔樹脂法是多糖類常用的純化方法,且純化效果較好。

本試驗以大孔樹脂法對葛根多糖進行純化研究;在靜態吸附的基礎上再用層析柱法考查樣液濃度和乙醇解吸的用量對葛根多糖純化的影響,采用紅外光譜對純化后的葛根多糖進行初步定性分析;再對葛根多糖溶液清除DPPH·和·OH的能力進行試驗探討研究[20-21],對葛根多糖進行純化及抗氧化性能初步研究,為葛根的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根干燥塊莖 選用廣西貴港野葛根;葡萄糖、水楊酸 分析純,天津市大茂化學試劑廠;苯酚、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、溴化鉀 分析純,西隴科學股份有限公司;單寧酸 分析純,天津市北方天醫化學試劑廠;二苯基苦基肼自由基 分析純,日本Wako公司。

AL104分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;V2000可見光分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SHZ-82A數顯恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;DHL-B恒流泵 上海青浦瀘西儀器廠;RE-52A真空旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;INVENIO R紅外光譜儀 布魯克科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根預處理 葛根塊莖洗凈放入烘箱在60 ℃下烘干,烘干后的葛根充分研磨,然后采用超聲水提法在超聲功率300 W、料液比18 g/mL、提取時間30 min的條件下提取一次,對提取液進行抽濾,濾液定容到100 mL容量瓶得到粗多糖提取液。

1.2.2 葛根多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法[22]測定葛根多糖純化前后的多糖含量。

1.2.3 葡萄糖標準曲線的繪制 配制濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標準液,分別量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標準液至10 mL具塞試管中,用蒸餾水加至1.0 mL,再移取1.0 mL的5%苯酚溶液加入到試管中,振蕩搖勻后迅速移取5.0 mL的濃硫酸放入試管中,振蕩搖勻靜置反應10 min,最后將試管在30 ℃水浴鍋內反應20 min。用分光光度計在490 nm處分別測量其吸光度值然后繪制標準曲線[23]。

1.2.4 樹脂吸附和解吸計算 大孔樹脂吸附和解吸實驗過程根據(1)～(4)公式[24]計算吸附量、吸附率、解吸量、解吸率。

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

式中:Q-樹脂吸附量(mg/g);E-樹脂吸附率(%);d-解吸量(mg/g);D-解吸率(%);C0-起始濃度(mg/mL);Ce-平衡濃度(mg/mL);V0-吸附液體積(mL);m-樹脂質量(g);Cd-解吸液濃度(mg/mL);Vd-解吸液體積(mL)。

1.2.5 大孔樹脂的預處理及篩選

1.2.5.1 大孔樹脂的預處理 稱取一定量的AB-8、X-5、S-8、H103、NKA-9、ADS-17、HPD-500、DM130、D101型大孔樹脂分別加入適量的95%乙醇浸泡24 h,讓樹脂充分溶脹,用無水乙醇清洗樹脂數次,至無白色渾濁,用蒸餾水將樹脂洗至無醇味;將無醇味的各大孔樹脂先浸泡在5%的鹽酸溶液,后浸泡在5%的氫氧化鈉溶液各12 h后用水洗為中性,預處理完的樹脂浸泡于蒸餾水中備用。

1.2.5.2 大孔樹脂的篩選 分別準確稱取2.0 g已預處理好的9種大孔吸附樹脂于250 mL錐形瓶中,在錐形瓶內各加入50 mL 0.9651 mg/mL的葛根多糖溶液,振蕩頻率100 r/min,溫度25 ℃,進行12 h靜態吸附。依次抽濾吸附平衡液,取出濾液至試管,取出樹脂至錐形瓶。加入50 mL 60%乙醇,進行12 h靜態解吸。對靜態吸附平衡液和解吸液進行測定,篩選出吸附效果和解吸效果最好的大孔樹脂[24]。

1.2.6 大孔樹脂靜態影響因素

1.2.6.1 樹脂靜態吸附平衡時間 取預處理過的D101樹脂2.0 g,放入250 mL的磨口錐形瓶中,添加50 mL 0.9651 mg/mL的葛根多糖水溶液,進行靜態吸附,設置振蕩頻率100 r/min,溫度25 ℃,讓其充分吸附11 h。每經過1 h用移液管移取一次0.2 mL吸附液,測定吸附液的吸光度計算其吸附量,作出吸附量與靜態吸附時間的曲線。

1.2.6.2 樹脂靜態解吸平衡時間 將吸附飽和的D101樹脂進行抽濾后放至磨口錐形瓶中,添加50 mL 60%的乙醇進行靜態解吸,設置振蕩頻率100 r/min,溫度25 ℃,充分靜態解吸樹脂7 h。每經過1 h取一次0.2 mL解吸液,測定解吸液的解吸量。

1.2.6.3 樣液濃度對樹脂靜態吸附的影響 將原溶液配制成1.0、0.75、0.5、0.25、0.10 mg/mL濃度的葛根多糖水溶液,進行靜態吸附,振蕩頻率100 r/min,溫度調為25 ℃,吸附8 h后測定平衡濃度,計算吸附量和吸附率。

1.2.6.4 樣液pH對樹脂靜態吸附的影響 取50 mL 0.5 mg/mL的葛根多糖水溶液5份,分別加入配制好的5%鹽酸和5%氫氧化鈉溶液進行pH調節,調pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,進行靜態吸附。振蕩頻率100 r/min,溫度25 ℃,充分吸附8 h后測定平衡濃度,計算吸附率和吸附量。

1.2.6.5 乙醇體積分數對樹脂靜態解吸的影響 取50 mL濃度為0.5 mg/mL的葛根多糖水溶液5份調節pH為6.0,振蕩頻率調為100 r/min,溫度調為25 ℃,充分吸附8 h后進行靜態吸附;用體積分數40%、50%、60%、70%和80%的乙醇進行靜態解吸3 h,計算解吸率。

1.2.7 影響樹脂動態吸附和解吸的因素 準確稱取已處理好的D101大孔樹脂20.0 g,使用濕法裝入規格為(1.5 cm×40cm)層析柱中,柱高度為20cm,進行動態分析。

1.2.7.1 上樣液質量濃度的影響 利用原溶液配制成0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL濃度的葛根多糖水溶液,在pH為6.0的條件下調節上樣速率為1.0 mL/min,各上樣體積為120 mL,動態吸附后測定多糖流出溶液的吸光度,計算其吸附率。

1.2.7.2 解吸劑體積對樹脂動態解吸的影響 將1.0 mg/mL的葛根多糖水溶液用5%的鹽酸溶液和5%氫氧化鈉溶液將其pH調節為6.0,上樣速度為1.0 mL/min,上樣溶液為120 mL;再用51 mL的60%乙醇進行動態解吸,設置洗脫液流速為1.5 mL/min,每3 mL收集一次解吸出來的溶液,測定每支試管溶液中多糖的濃度。

1.2.8 葛根多糖的紅外光譜分析 稱取1.0 mg洗脫后干燥的葛根多糖粉末樣品和100 mg KBr混合充分研磨后壓片,使用紅外光譜掃描儀設置在波長范圍為4000～400 cm-1[25]內掃描,觀察吸收峰,分析紅外光譜圖。

1.2.9 葛根多糖的抗氧化性能研究 按楊佳琦等[26]、張成等[27]和Yin等[28]的文獻方法稍作修改,分別配制濃度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的葛葉多糖水溶液,以單寧酸作對照組,測定純化前和純化后的葛根多糖溶液在510和517 nm處吸光度的變化曲線分析清除·OH和DPPH·的能力。

1.3 數據處理

各理化指標測定3次,求取平均值減少數據誤差。使用Origin 8.0進行數據分析處理和繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

由圖1可知,標準方程式為:Y=58.905X-0.0911,決定系數為R2=0.9986,表明在濃度0.002～0.015 mg/mL范圍內,葡萄糖濃度與吸光值呈良好的線性關系,適用于葛根多糖含量測定。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 大孔樹脂的篩選

由表1可知,吸附率:NKA-9>D101>S-8>AB-8>DM130>ADS-17>HPD500>X-5>H103;解吸率:H103>DM130>HPD500>ADS-17>D101>S-8>NKA-9>AB-8>X-5。

表1 不同樹脂對葛根多糖靜態吸附和解吸結果

由于大孔樹脂的孔徑、極性、比表面積的不同,對葛根多糖的吸附及解吸的效果也會存在優劣。在上面9種樹脂中吸附率最高的是NKA-9,但是它的解吸率較低;解吸率最高的樹脂是H103,而它的吸附率只有55.82%;D101的比表面積和孔徑都在其他樹脂大小之上,吸附能力和解吸能力也相對較強。綜合吸附率和解吸率,最優的是D101型號的樹脂。

2.3 樹脂靜態吸附和解吸的主要影響因素

2.3.1 樹脂靜態吸附平衡時間 由圖2可知,大孔樹脂D101對葛根多糖靜態吸附為中速平衡型,0～5 h曲線增長較快,吸附量變化幅度也很大,5 h以后吸附量逐漸減緩,在8 h后吸附量基本不變,多糖濃度也基本不再改變,大孔樹脂吸附達到平衡,所以吸附平衡時間選擇8 h。

圖2 樹脂靜態吸附曲線

2.3.2 樹脂靜態解吸平衡時間 由圖3可知,大孔樹脂D101對葛根溶液靜態解吸呈現快速平衡型增長,0～3 h增長較快,解吸量變化幅度較大,在3 h以后解吸量基本不變,葛根多糖濃度也基本不再改變,大孔樹脂解吸達到平衡,所以解吸平衡時間選擇3 h。

圖3 樹脂靜態解吸曲線

2.3.3 樣液質量濃度的影響 由圖4可知,大孔樹脂D101吸附量隨多糖溶液濃度增加而增加,而吸附率隨著多糖濃度的增大呈現先下降再升高再下降的趨勢。吸附量最大時吸附率降低推測是因為隨著多糖濃度的增加,溶液中的雜質含量增多,與葛根多糖競爭吸附樹脂位點,因此吸附率下降。最終選擇0.75 mg/mL多糖濃度為樣液濃度。

圖4 樣液濃度對靜態吸附率和吸附量的影響

2.3.4 樣液pH影響 由圖5可知,大孔樹脂D101對多糖吸附量和吸附率隨著pH升高而逐漸增大,且兩者變化趨勢基本一致,在6.0時為最大值,即分別為5.6952 mg/g和45.56%,之后呈現下降趨勢,主要原因是多糖類物質在酸和堿下易于發生水解反應,在微酸性條件下樹脂活性比較強,容易吸附。綜合各方面和變化曲線考慮樣液pH為6.0較適宜。

圖5 樣液pH對靜態吸附率和吸附量的影響

2.3.5 乙醇體積分數的影響 由圖6可知,大孔樹脂D101對葛根多糖解吸率隨著乙醇體積分數變大而快速增大,當濃度為60%,解吸率為65.13%時,解吸率曲線開始出現下降趨勢,而乙醇濃度的增加使大孔樹脂和葛根多糖之間的作用力削弱,濃度過大過小都不利于解析,所以選擇乙醇濃度60%比較適宜。

圖6 乙醇體積分數對樹脂靜態解吸率的影響

2.4 影響樹脂動態吸附和解吸的因素

圖7 多糖樣液濃度對動態吸附率的影響

2.4.1 樣液多糖濃度對樹脂動態吸附的影響 由圖7可知,大孔樹脂D101吸附率隨多糖濃度增加呈現先上升后下降趨勢,在濃度1.0 mg/mL時吸附率達到最大57.33%,當濃度增大到1.4和1.8 mg/mL時多糖樣液未能被樹脂吸附,從而濃度增加時吸附率不發生變動,由此可以看出樹脂在多糖濃度為1.0 mg/mL的時候達到飽和。

2.4.2 解吸劑體積對樹脂動態解吸的影響 由圖8解吸曲線圖和實際樣液顏色變化可知,前3樣液試管基本為無色,從第4樣液試管開始顏色變為淡黃色溶液,顏色在第10樣液試管為最深的黑棕色,即該管洗脫液濃度最大,第17管開始慢慢顏色變淺,到第20管試管開始顏色變為淡黃色且逐漸變為無色。由此可見,當葛根多糖完成基本解吸時解吸劑體積為51 mL,由圖8可看出,曲線對稱性較好,解吸峰較集中,沒有明顯的曲線拖尾現象。

2.4.3 葛根多糖紅外光譜分析 由圖9知,純化后的葛根多糖具有一般多糖的紅外光譜特征性結構[12],在3401 cm-1附近出現較寬吸收峰是因為糖類O-H鍵伸縮振動的結果。另外在2934 cm-1附近出現的吸收峰是糖類C-H鍵伸縮振動引起的,這兩組峰均屬于多糖類的特征吸收峰。而在1630 cm-1附近出現的吸收峰為糖醛酸中自由羧基的振動吸收峰。從以上特征峰說明純化后的產物為多糖類物質。

圖9 葛根多糖純化后紅外掃描圖

2.5 葛根多糖分離純化結果

按照以上的最優條件,將處理好的D101樹脂在吸附時間為8 h,吸附濃度0.75 mg/mL,樣液pH6.0,解吸時間為3 h,乙醇解吸體積分數為60%的條件下對葛根多糖進行靜態分析,再用層析柱法進行動態純化。對純化后的樣品進行紅外掃描,由紅外譜圖得知純化后的葛根多糖具有多糖特征吸收峰。對純化后的葛根多糖進行含量測定,計算出多糖含量為55.34%,而未純化之前多糖含量為30.23%,說明此方法純化效果良好。

2.6 葛根多糖的抗氧化性能研究

2.6.1 葛根多糖溶液濃度對清除DPPH自由基的影響 從圖10可知,單寧酸的清除率最大,其次為純化后的多糖溶液,未純化的多糖溶液清除率最小,三者的清除率隨濃度的增加而增加,但清除率變化曲線比較平緩。在實驗濃度范圍內,單寧酸、純化后多糖溶液和未純化多糖溶液在濃度為1.2 mg/mL時對DPPH自由基有最大清除率,分別為91.78%、81.74%、65.28%。

圖10 樣液濃度對DPPH自由基清除率的影響

2.6.2 葛根多糖溶液濃度對清除羥基自由基的影響 從圖11可知,單寧酸對羥基清除率最大,整體隨濃度的增加平緩的上升,純化后多糖溶液和未純化多糖溶液在0.4～0.8 mg/mL隨濃度的增加呈較陡的上升趨勢,而在0.8～1.2 mg/mL濃度范圍變為平緩上升趨勢。在實驗濃度范圍內,單寧酸,純化后多糖溶液和未純化多糖溶液在濃度為1.2 mg/mL時對·OH有最大清除率,分別為90.94%、85.11%、77.36%。

圖11 樣液濃度對羥基自由基清除率的影響

2.6.3 葛根多糖抗氧化性結果 在研究葛根多糖抗氧化性時,以單寧酸為試驗對照組,分析葛根多糖純化前后對DPPH·和·OH的清除率。未純化的葛根多糖對DPPH·和·OH的清除率為65.28%和77.36%,其純化后對DPPH·和·OH的清除率為81.74%和85.11%。結果顯示純化后的葛根多糖相比未純化時抗氧化清除自由基能力增強,且抗氧化能力隨著多糖純度的增大而增強,說明葛根多糖成分在抗氧化作用中起著主要作用,可能因為純化后的葛根多糖中糖醛酸的含量增高,而糖醛酸含量的增高與自由基清除能力和抗氧化活性存在直接關系[13]。

3 結論

通過試驗尋找到D101型大孔樹脂對葛根多糖具有較好的吸附和解吸效果,對多糖的吸附率和解吸率分別為60.39%和70.35%。對葛根多糖溶液進行純化研究,當溶液pH為6.0,乙醇體積分數60%,吸附時間8 h,解吸時間3 h,吸附濃度0.75 mg/mL時為最佳純化工藝,純化后的葛根多糖具有多糖特征吸收峰,且純化后葛根多糖純度達到55.34%。由于多糖純度的提高,純化后多糖對DPPH·最大清除率達到81.74%和85.11%。葛根多糖較強的抗氧化性,在糖類功能性食品藥物和醫療中應用廣泛,這對葛根的綜合開發利用具有重要意義。