大孔樹脂分離純化熟地黃黃酮及其對小鼠運動耐力的影響

耿 杰,梅子萍,董功武

(南昌理工學院,江西南昌 330044)

熟地黃是中藥地黃炮制加工后的成品,為藥食同源物質,具有補血滋潤、益精填髓功效[1-2],因其富含多糖、梓醇、黃酮、維生素A、氨基酸等化合物,被用作制備牛奶、保健飲料等食品[3-4]。其中的黃酮類化合物是一類含氧雜環的天然有機物,具有調節血脂、抗氧化、快速消除體內氧自由基,增強機體免疫的作用[5-6]。有研究發現身體疲勞導致的運動耐力下降,與體內氧自由基的快速增多,造成體內線粒體呼吸鏈產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)過程受損有關,上述過程使得細胞能量合成發生障礙,影響肌纖維收縮功能,出現組織損傷、肌肉收縮能力下降等現象,而對機體補充外源性抗氧化劑是增強運動耐力的有效方法之一[7-8]。

目前熟地黃中已知化學成分的體內、外抗氧化研究,集中于辛梓醇或多糖化合物,對其黃酮類化合物的研究卻鮮有公開。雖有文獻報道,超聲或酶法提取熟地黃黃酮,但產物的純度較低[9-10],可能影響其功效的發揮。大孔樹脂吸附分離,綜合機械篩分與化學吸附的優點,具有選擇性高、干擾因素少、可重復循環利用等特點,已被大量用于天然產物有效成分的分離與純化[11-12]。因此,本研究在提取工藝研究基礎上,探討大孔樹脂純化熟地黃黃酮化合物的最佳工藝條件,并考察其對動物運動耐力的影響,為熟地黃后期開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熟地黃、西洋參 購置于江西昌盛大藥房;西洋參膠囊(規格:0.5 g/粒) 金日制藥(中國)有限公司;蘆丁對照品(UV>92.4%,含量測定用) 中國藥品生物制品檢定研究院;無水乙醇、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;血乳酸(BLA)、血尿素氮(BUN)、肌糖原(MG)、肝糖原(HG)檢測試劑盒 南京信帆生物有限公司;試驗用水 為二次純化水;健康雄性昆明系小鼠 100只,體質量15～22 g,江西省實驗動物中心提供(許可證號:SYXK 2018-0006),生長環境溫度20～25 ℃,相對濕度50%～70%。

721型紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;ME104型電子天平 梅特勒-托利多公司;JY96-II型超聲波細胞粉碎機 上海熙揚儀器有限公司;PR-2型旋轉蒸發儀普瑞科技有限公司;VFD-1000A型冷凍干燥箱 上海舜制儀器制造有限公司;TD4型高速離心機 鹽城凱特實驗儀器有限公司;ZWY-110X50型恒溫振蕩器 北京海天友誠科技有限公司;AB-8、H-103、D-101、DM301大孔樹脂 天津西金納環保材料科技有限公司;HPD 400、DM-130大孔樹脂 河北寶恩化工有限公司;動物恒溫游泳池 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物制備 參照相關文獻方法[9],熟地黃經60 ℃干燥至恒重后粉碎,過60目篩,準確稱取25 g過篩樣品,置于500 mL 75%乙醇溶液內,于135 W功率超聲波下提取45 min,離心后的上清液旋轉蒸發回收溶劑,經冷凍干燥即得熟地黃總黃酮粗品,備用。

1.2.2 黃酮含量測定 參考文獻方法[10],以標準溶液的不同質量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線,得到標準曲線回歸方程如下:y=3.125x+0.0136(R2=0.9982),表明蘆丁濃度在0.04～0.4 mg/mL范圍內,線性關系良好,同時于510 nm波長下測定樣品的吸光度值,平行測定五次,根據標準曲線回歸方程,得到樣品溶液中黃酮質量濃度,通過下式計算樣品含量。

式(1)

式中m0為熟地黃樣品質量,mg;c為產物的黃酮質量濃度,mg/mL;V為樣品溶液體積,mL;D為稀釋倍數。

1.2.3 樹脂類型選擇 準確稱取5.0 g極性不同的預處理后的六種大孔樹脂(AB-8、H-103、D-101、DM301、HPD 400、DM-130)置于錐形瓶內[13],分別加入5 mg/mL 50 mL提取液后,置于恒溫振蕩器內,靜態吸附12 h后過濾,測得吸附后濾液中總黃酮的質量濃度,通過下式計算不同型號大孔樹脂的吸附率[14]。

式(2)

式中:m0為提取液中總黃酮質量,mg;me為飽和吸附后濾液中總黃酮質量,mg;Qe為飽和吸附率,%。

將飽和吸附后的樹脂置于錐形瓶內,加入100 mL 80%乙醇溶液后,置于恒溫振蕩器中,靜態洗脫12 h,過濾,測定濾液中總黃酮的濃度,通過下式計算不同型號樹脂的洗脫率與回收率[15]。

(3)

式(4)

式中:m0為提取液中總黃酮質量,mg;me為飽和吸附后濾液中總黃酮質量,mg;md為洗脫液中總黃酮質量,mg;Dd為洗脫率,%;R為回收率,%。

1.2.4 動態吸附與洗脫條件考察

1.2.4.1 不同吸附工藝條件影響 根據預實驗結果,分別考察上樣液質量濃度、上樣液pH、上樣流速及上樣液體積對吸附率的影響,具體如下:當上樣液pH為5.0,上樣流速為2 mL/min,上樣液體積為60 mL時,上樣液質量濃度分別為:2、4、6、8、10 mg/mL;當上樣液質量濃度為8 mg/mL,上樣流速為2 mL/min,上樣液體積為60 mL時,上樣液pH分別為:3、4、5、6、7;當上樣液質量濃度為8 mg/mL,上樣液pH為5.0時,考察不同上樣流速(0.5、1.0、2.0 mL/min)的樹脂泄漏曲線。

1.2.4.2 不同洗脫工藝條件影響 以乙醇溶液作洗脫液,分別考察洗脫液濃度、洗脫流速和洗脫液體積對洗脫率的影響,具體如下:當洗脫流速為1 mL/min,洗脫液體積為150 mL時,洗脫液濃度分別為:50%、60%、70%、80%、90%;當洗脫液濃度為80%時,考察不同洗脫流速(1、2、3 mL/min)的樹脂洗脫曲線。

1.2.5 動物運動耐力研究 100只小鼠經適應性喂養5 d后,隨機平均分為5組,每組20只,分別為空白對照組(BG)、陽性對照組(PG)和低(L-FG)、中(M-FG)、高(H-FG)劑量的純化產物組,參考相關文獻的用量設計[16-17],確定空白對照組灌胃生理鹽水0.1 mL/g·bw(以體質量計,下同);陽性對照組則灌胃西洋參膠囊內西洋參粉0.10 mg/g·bw;低、中、高劑量組則分別灌胃0.05、0.10、0.15 mg/g·bw的黃酮純化產物,每只小鼠每天灌胃一次,結束后休息30 min,開展游泳訓練,連續30 d,研究期間各組動物的喂食與飲水正常進行。

1.2.5.1 負重游泳實驗 第30 d灌胃結束30 min后,每組隨機選取10只小鼠于尾部負重自身5%體質量的重物,開展負重游泳試驗,記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s的時間,作為力竭游泳運動時間[18]。

1.2.5.2 運動耐力評價指標測定 每組剩余10只動物于第30 d灌胃結束后30 min,進行不負重游泳運動30 min,隨后取出擦凈,放回鼠籠休息10 min后,摘取眼球,抽血離心,收集血清,同時分取肝與肌肉組織,利用相關試劑盒,分別測得不同組別小鼠肝臟中肝糖原濃度、肌肉中肌糖原濃度和血清中乳酸、尿素氮濃度[19]。

1.3 數據統計分析

相關評價指標均采用均數、標準差描述,利用SPSS 19.0進行方差分析,檢驗水準α=0.05,當P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 提取物粗黃酮含量

按照1.2.2操作步驟,測定提取物樣品溶液于510 nm波長處吸光度值,并利用標準曲線,計算得到提取物中總黃酮含量為2.52%±0.10%。

2.2 樹脂型號選擇

表1為不同極性大孔樹脂的靜態吸附率、洗脫率和回收率比較,從表1可見,各種型號樹脂對熟地黃黃酮的吸附能力不同,其中H103大孔樹脂的吸附率最大,達到86.6%,其次為D101大孔樹脂,而D101大孔樹脂對目標產物的靜態洗脫率略大于H103樹脂,但考慮H103大孔樹脂的回收率更高,因此確定H103大孔樹脂作為熟地黃黃酮提取物的純化樹脂。

表1 不同樹脂的靜態吸附與洗脫性能比較(n=5)

2.3 吸附工藝條件考察

2.3.1 上樣液質量濃度對吸附率影響 上樣液質量濃度過大,會引起樹脂的堵塞與泄露,而濃度過低,又影響吸附效率,為此分別考察不同上樣液質量濃度對吸附率的影響,結果見圖1。隨著上樣液質量濃度的增大,樹脂對黃酮的吸附率不斷升高,至8 mg/mL開始下降,因此確定最佳上樣液質量濃度為8 mg/mL。

圖1 上樣液濃度對吸附率的影響

2.3.2 上樣液pH對吸附率影響 當黃酮類化合物呈分子態時,與樹脂的相互作用較好,而溶液pH可能影響目標產物的化學結構,為此分別考察不同上樣液的pH對吸附率的影響,結果見圖2。當上樣液pH為5時,樹脂對黃酮類化合物的吸附率達到最大,這歸因于在弱酸性溶液中黃酮類化合物的羥基既不易于生成“徉鹽”,也不易于形成離子態結構[20],因此確定最佳上樣液pH為5。

圖2 上樣液pH對吸附率的影響

2.3.3 不同上樣流速的樹脂吸附泄漏曲線 若上樣流速過快,且上樣液體積過大,不僅使得目標產物不能與樹脂充分接觸,也可能容易造成樹脂過載而泄露,為此分別考察不同上樣流速的樹脂吸附泄露曲線,結果見圖3。通常將流出液中目標化合物的濃度達到10%上樣液質量濃度,認定為樹脂吸附泄漏點[21],從圖3可見,隨著上樣流速的增大,達到樹脂吸附泄漏點的上樣液體積不斷降低,當上樣流速為1 mL/min時,樹脂的吸附率和達到樹脂吸附泄露點的上樣液體積最大,但考慮實際工業應用的吸附效率,確定最佳上樣流速為2 mL/min,上樣液體積為60 mL。

圖3 不同上樣流速的樹脂吸附泄露曲線

2.4 洗脫工藝條件考察

2.4.1 洗脫液濃度對洗脫率影響 洗脫液的濃度影響其極性強弱,進而影響對目標產物的洗脫效果,為此分別考察不同濃度乙醇溶液對目標產物的洗脫率影響,結果見圖4。洗脫液乙醇對熟地黃總黃酮的洗脫率隨著洗脫劑的濃度增大呈先升高后降低的趨勢,當洗脫液濃度為80%時,極性較弱,與目標產物的作用力較強,但當濃度過高時,吸附在樹脂上的其它雜質將與目標產物競爭結合,使得洗脫率下降,因此確定洗脫液乙醇的最佳濃度為80%。

圖4 洗脫液濃度對洗脫率的影響

2.4.2 不同洗脫流速的樹脂洗脫曲線 圖5為不同洗脫流速的樹脂洗脫曲線,從圖5可知,隨著洗脫流速的增大,曲線的拖尾現象較為明顯,且峰型逐漸變寬,當洗脫流速為1 mL/min時,洗脫曲線峰型較為尖銳、單一和對稱,因此確定最佳洗脫流速為1 mL/min,洗脫體積用量為150 mL。

圖5 不同洗脫流速的樹脂洗脫曲線

2.5 最佳純化工藝驗證

照上述最佳純化工藝條件,即pH為5.0,質量濃度為8 mg/mL上樣液60 mL,以2 mL/min流速,上樣至H103大孔樹脂飽和吸附后,采用150 mL 80%乙醇溶液,以1 mL/min流速洗脫,測得吸附率與洗脫率分別為85.7%和90.2%,產物的總黃酮含量由純化前2.52%±0.10%提高至純化后12.18%±1.69%,約為純化前4.8倍,而劉宛玲等采用大孔樹脂純化麥胚中總黃酮,產物含量約為純化前12.26倍[22];李玉娟等采用大孔樹脂純化瑪咖總黃酮,產物含量為約為純化前5.6倍[23],表明該工藝分離效果較好,適于熟地黃黃酮類化合物的純化。

2.6 負重游泳時間比較

負重游泳是常見評估機體運動耐力的實驗模型,具有較好的重現性,小鼠在負重游泳時,肌肉消耗糖原,血糖水平下降,使得中樞神經系統供能不足,導致全身性疲勞產生,影響運動耐力[24],利用該模型考察不同劑量純化產物對小鼠的負重游泳時間長短的影響,結果見圖6所示。

圖6 純化產物對小鼠力竭游泳時間影響

從圖6可知,與空白對照組(BG)相比,陽性對照組(PG)與三個黃酮純化產物組(L-FG、M-FG、H-FG)的力竭游泳運動時間均有延長,延長率分別為13.7%、4.0%、8.1%、12.1%。其中低劑量組與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05),而中(M-FG)、高劑量組(H-FG)、陽性對照組(PG)與空白組對比具有極顯著性差異(P<0.01),表明熟地黃黃酮的純化產物可延長小鼠運動時間,提高其運動耐力。

2.7 運動后體內生化指標比較

2.7.1 乳酸濃度比較 血糖是提供機體運動能量的主要來源之一,當機體高強度運動后會造成體內部分細胞缺氧,致使血糖發生糖酵解反應生成乳酸,蓄積在骨骼肌等組織中,出現四肢酸痛,影響機體耐力[25],因此分別測定運動后不同組別小鼠的體內乳酸含量,結果見圖7所示。

圖7 純化產物對小鼠乳酸濃度影響

從圖7可知,三個黃酮純化產物組(L-FG、M-FG、H-FG)的動物體內乳酸濃度分別比空白對照組(BG)降低4.7%、14.0%、19.8%,其中低劑量組(L-FG)的小鼠體內乳酸濃度與空白對照組(BG)相比,有顯著性差異(P<0.05),而中劑量組(M-FG)、高劑量組(H-FG)、陽性對照組(PG)的動物體內乳酸濃度均極顯著低于空白對照組(P<0.01),顯示熟地黃黃酮的純化產物可加快運動后體內的乳酸代謝,達到提高運動耐力的目的。

2.7.2 尿素氮濃度比較 當機體劇烈運動,血糖供應不足時,體內蛋白質將加快分解利用,血清中尿素氮濃度持續升高[26],因此將體內尿素氮濃度作為間接反映機體運動耐力的指標,運動后不同組別動物體內尿素氮濃度的比較,見圖8所示。

圖8 純化產物對小鼠尿素氮濃度影響

從圖8可知,三個不同劑量黃酮純化產物組(L-FG、M-FG、H-FG)的動物體內尿素氮濃度分別與空白對照組(BG)相較,下降2.0%、4.2%、7.5%,與空白對照組動物體內的尿素氮濃度相較,低劑量組(L-FG)無顯著性差異(P>0.05),中劑量組(M-FG)有顯著性差異(P<0.05),而高劑量組(H-FG)與陽性對照組(PG)有極顯著性差異(P<0.01),表明熟地黃黃酮純化產物有利于在機體運動時,減少體內蛋白質的分解利用。

2.7.3 肝、肌糖原濃度比較 肝糖原與肌糖原是機體的重要儲能物質,當體內血糖不能維持高強度運動時,兩種糖原先后各自分解成葡萄糖,以維持體內血糖水平[27],黃酮純化產物對運動后不同組別小鼠的肝、肌糖原濃度影響,見圖9所示。

圖9 純化產物對小鼠肝、肌糖原濃度影響

從圖9可知,與空白對照組(BG)相比,陽性對照組(PG)和三個黃酮純化產物組(L-FG、M-FG、H-FG)的動物體內肝、肌糖原濃度均有提高,其中低劑量組(L-FG)、中劑量組(M-FG)的小鼠體內肝、肌糖原濃度與空白對照組(BG)相比,有顯著性差異(P<0.05),而高劑量組(H-FG)、陽性對照組(PG)與其有極顯著性差異(P<0.01),表明熟地黃黃酮純化產物有助于提高體內的肝、肌糖原儲備,延長運動時間。

3 結論

本研究探討了大孔樹脂純化熟地黃黃酮的最佳工藝條件,當pH為5.0,質量濃度為8 mg/mL上樣液60 mL,以2 mL/min流速,上樣至H103大孔樹脂飽和吸附后,采用150 mL 80%乙醇溶液,以1 mL/min流速洗脫時,產物的總黃酮含量由2.52%提高至12.18%,約為純化前4.8倍,表明該最佳工藝操作簡便、純化效率較高。同時,動物實驗表明,中、高劑量的黃酮純化產物均有利于加快體內乳酸代謝,減少尿素氮生成,并利于提高體內肝糖原與肌糖原的儲備,從而明顯增強機體運動耐力。因此,本研究對熟地黃總黃酮的純化及后期深度開發具有指導意義。