一種甜菊糖轉化產物分析檢測方法的建立

皇甫瑞娟 姜雪(寧夏工商職業技術學院 能源化工學院，寧夏 銀川 750021)

0 引言

糖在我們的日常生活中起著重要的作用，不管是作為能量來源之一還是作為食品甜味劑，都是我們生活所離不開的。當前可供人們食用的甜味劑很多，如甜度最高的蔗糖，適用于糖尿病人服用的木糖醇，另外還有果糖、乳糖、山梨醇等多種甜味劑。

甜菊糖是一種從甜味菊莖葉中提取的天然甜味劑[1]，是幾種甜菊苷混合物，其化學通式為(C5H8)4。我國早在1980年左右就獲得了甜菊糖苷，即“甜菊糖”。經大量藥物實驗證明，甜菊糖無毒副作用，無致癌物，食用安全，經常食用可預防高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥，是一種可替代蔗糖非常理想的甜味劑[2]。但美中不足的是甜菊糖有著嚴重的苦澀后味，與蔗糖優良的口感不能相比，從而至今尚未被市場消費者所接受。因此，努力改進甜菊糖苷的苦澀后味是目前研究的熱點問題之一。

甜菊糖是白色至微黃色結晶性粉。熔點198℃。1g該品可溶于800ml水，微溶于乙醇。比旋光率[α]20/D 為-39.3°(C=5.7，H2O)。在空氣中迅速汲濕。耐高溫，在酸性及堿性溶液中比較穩定[2]。近些年對甜菊糖研究報道較多，對其成分分析檢測方法各異，其中高效液相(HPLC)色譜法因分離效率高、檢測靈敏度高和分析速度快的優點，應用較為廣泛。但由于檢測條件各不相同，其檢測效果也各有差異。本文通過實驗，建立了高效液相色譜(HPLC)對甜菊糖轉化產物的檢測方法，為進一步研究提供了基礎。

1 材料與儀器

1.1 色譜儀的選擇

高效液相色譜儀因為分析速度快，分離效率高，在較短分析時間內可以獲得很高的柱效和較高的分離能力。對沸點高、分子量大、受熱易分解的有機物、生物活性物質以及多種天然產物，分離較好，檢測靈敏度也較高，因此應用范圍十分廣泛。通常，高效液相色譜儀是由高壓輸液系統、進樣器、色譜柱、檢測器、色譜工作站等幾部分組成。在測定樣品對紫外或者可見光的吸收程度時，通常用到紫外可見光吸收檢測器以及光二極管陣列檢測器(PAD)兩種。用UV-VIS檢測器檢測的化合物應有相應的吸收基團，并且要知道這個吸收基團的最大吸收波長是多少。因為只有在吸收基團的最大吸收波長附近檢測才可以得到高靈敏度和寬線性范圍。PAD檢測器的優點是可以獲得樣品組分的光譜信息，可以定性判定或鑒定不同類型的化合物，同時對未分離組分可以判斷其中的純度情況；同時，該檢測器的波長無需事先設定，根據各個組分的吸收峰的波長選擇最佳值后進行定量分析。PAD類檢測器盡管具有較高的靈敏度，但是與單波長吸收檢測方法相比，其靈敏度和線性范圍均不如單色光高。主要是單波長檢測器所用的光敏元件檢測效率高，如果采用光電倍增管放大效率更為顯著；同時，多波長吸收與單波長吸收所得到的結果也有差別。因此，目前的檢測器靈敏度可調波長檢測器比二極管陣列高約一個數量級左右。在低濃度樣品分析時，采用單波長檢測器獲得的定量結果更加準確。本實驗所用的HPLC為Waters 2695 系統，軟件為Empower。該儀器由Waters 2695分離單元、2996型二極管陣列檢測器、2420蒸發光散射檢測器、色譜管理工作站和打印機等部分組成。

1.2 色譜柱的選擇

色譜是一種分離分析手段，因此，色譜柱是高效液相色譜儀的核心部件。柱效高、選擇性好、分析速度快是對色譜柱的一般要求。目前市售的高效液相色譜分離柱的內徑有4.6mm和3.9mm兩種規格，柱長一般用100～300mm就能滿足復雜混合物的分析要求。本實驗用HPLC來分析甜菊糖轉化產物的情況，故屬于分離糖類物質[3]，同時應用反相液相色譜的分離方法，選用了一根Waters Sunfire C18(4.6×150mm 5μm)柱，該柱填料為球形硅膠鍵合C18并采用了新型的鍵合和端基封尾技術，能夠提供完美的色譜峰型。

2 色譜條件的確立

在進行正式的實驗之前，首先需要確立色譜檢測條件，主要是對流動相流速、流動相配比、色譜柱長度、色譜柱溫度等因素進行優化，以便得到最好的檢測效果。對于Waters2695來說，開機之前首先需要對樣品和流動相進行過濾(通常過0.22μm濾膜)，過濾完畢再超聲脫氣10min左右。更換四元泵流動相，通常A為甲醇、B為乙腈、C為水、D為緩沖鹽。

整個實驗過程結束后，要沖洗系統、色譜柱。沖洗原則：C18柱先用水(90%左右，具體需根據色譜柱要求)沖洗水溶性物質，逐漸增加有機相比例，最終色譜柱保存于100%乙腈(或其它有機相)。關閉軟件和電腦，設流速為“0”，關脫氣機，關閉主機和檢測器的電源。

2.1 第一次預實驗

第一次預實驗選擇了以下參數，如表1所示。

在上述條件下檢測出的色譜圖，如圖1所示。

結果分析：由以上色譜圖可以看出，兩主要組分未分開，預計是有機相比例較高，洗脫能力較強，出峰快所導致。下一步將降低有機相比例。

表1 第一次預實驗參數

圖1 第一次預實驗結果檢測色譜圖

2.2 第二次預實驗

第二次預實驗，在其他條件不變的情況下將乙腈和水的比例降低，使乙腈:水＝30:70，這次檢測出的色譜圖，如圖2所示。

結果分析：從這次的結果中可以看出，改變有機相比例使得兩主要組分的分離效果有所改善，但還是沒有完全分開，這是我們所不愿意看到的。但是繼續降低有機相比例將會導致出峰過慢、檢測時間長，故下一步計劃增加柱長，以增強分離效果。

2.3 第三次預實驗

在第三次預實驗中，使用了一根SunFire TM C18 5μm，4.6×250mm柱子，比原來的柱長多了100mm，理論上結果會好一些，這次檢測的色譜圖，如圖3所示。

通過這次的結果可以看出，主要組分的峰基本分開，結果比較理想。至此檢測條件初步確立。在后續的實驗過程中，都將使用以下的條件做檢測，如表2所示。

3 結語

甜菊糖可廣泛用于食品、飲料、醫藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業，并且較應用蔗糖可節省成本70%。甜菊糖色澤純白，口感適宜，無異味，是發展前景廣闊的新糖源。甜菊糖是目前世界已發現并經我國衛生部、輕工業部批準使用的最接近蔗糖口味的天然低熱值甜味劑。是繼甘蔗甜菜糖之外第3種有開發價值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國際上譽為“世界第三蔗糖”。本文采用實驗方法確立了HPLC法測定甜菊糖轉化產物分析方法的最優色譜條件。為后續酶法對甜菊糖改性實驗奠定了基礎。

圖2 第二次預實驗結果檢測色譜圖

圖3 第三次預實驗結果檢測色譜圖

表2 甜菊糖轉化產物色譜條件