煙曲霉在果樹生產上的安全應用探討

摘 要：通過煙曲霉利用農作物秸稈對果樹生產安全應用的可行性進行闡述，在增加土壤肥力、防治果樹病蟲害、治理果園環境污染3個方面具有的潛在應用價值進行了分析。

關鍵詞：煙曲霉;果樹;安全應用;秸稈

文章編號：2096-8108（2020）03-0065-04?中圖分類號：S66?文獻標識碼：A

Abstract：The feasibility of using crop straw by Aspergillus fumigatus in the production and safety of fruit trees was discussed. It is potentially used for increasing soil fertility， controlling crop diseases and decreasing agricultural environmental pollution.

Keywords：Aspergillus fumigates; Fruit tree; Safe application; Crop straw

長期以來，化肥、農藥和薄膜是果農實現增產增收的重要手段，病蟲害是影響果樹生產的一個重要問題。目前，過度施肥、殘留高劑量農藥、白色污染或是秸稈焚燒都會影響地區農產品銷售的信譽和口碑。因此，防治果樹病蟲害、治理果樹環境污染和提高農作物秸稈利用率意義重大。煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是在世界范圍內廣泛存在的一類真菌，耐鹽，耐高溫（30～40 ℃），遺傳性狀穩定。早在20世紀40年代，已經有報道列出從煙曲霉代謝中分離到的一種物質煙曲霉酸（Fumigacin）可以作為殺菌劑應用于農業生產[1]，這種殺菌劑來源天然，研究認為能阻斷病原真菌蛋白質合成[2]。多年來，煙曲霉的應用一直有文獻報道，已證明對果樹生產環境中的有機質[3]、殘留農藥污染[4-6]、廢棄農用薄膜污染[7]和蒽污染[8]均有很好地降解作用。利用煙曲霉高效的生物降解能力及其次生代謝產物的高生物活性，以再利用的農作物秸稈作為碳氮源制成的煙曲霉具有潛在的應用價值。

1?果樹生產的安全性

1.1?活體煙曲霉的鑒定

煙曲霉是否安全，首先要對果樹內的真菌進行培養分離鑒定。煙曲霉活體菌株的檢測方法主要以真菌形態學和分子生物學手段進行。

不同地區的煙曲霉在真菌形態學上趨于一致：致密圓柱形的分生孢子頭、頂囊的形狀和分生孢子的特征，因此基于標準培養基上的菌落生長形態、顏色、顯微形態以及色素形成等情況，在加上通過鏡檢可以基本判斷適合一些像煙曲霉比較常見的菌株。平板培養觀察煙曲霉菌落有輻射狀皺紋，非標準培養基上基內菌絲根據底物營養不同，呈青黃色到煙土色不一。鏡檢下，煙曲霉產孢結構有類似的傘狀結構，分生孢子梗發生于基質，菌絲有隔，分生孢子球形。孢子體積較小，在空氣中易飄散，普通光學顯微鏡須在放大1 000倍（100×10）下能夠清楚觀察到孢子形態。這樣的傳統形態學方法觀察則比較簡單方便。

利用分子生物學檢查也是目前最常用的手段，菌株的鑒定不會受到實驗人員的經驗水平影響，比較客觀[9]。并且煙曲霉基因序列相對保守[10]，一般采用rDNA-ITS序列分析即可鑒定菌種。

1.2?次生代謝產物的安全性

煙曲霉活體菌株鑒定雖然解決的菌種定性的問題，但無法區分是否為帶毒菌株。煙曲霉有毒的次生代謝產物多以震顫真菌毒素（Verruculogen）、煙曲霉震顫素B（Fumitremorgin B）、膠毒霉素（Gliotoxin）等為標志化合物，這些代謝產物結構獨特，利用色譜、光譜和質譜技術定性分析，或利用核磁共振技術進行結構鑒定，可作為帶毒菌株的定性分析，但使用和維護費用較為昂貴。

目前，真菌毒素在食品原料和（或）食品成品可食用部分中允許的最大含量水平在0.5～60 μg/kg[11]。以煙曲霉中的膠毒霉素為例，其產量約在15 mg/L[12]，控制水量稀釋800～1 000倍制成對有助于保證次生代謝產物在果樹生產的安全性。

1.3?生產環境的安全性

煙曲霉一直被認為對人和牲畜較為危險的致病真菌[13]，其發酵產物經常用于曲霉病發病機制的模型建立[14，15]，但從果樹生產環境的角度看，作為天然存在的菌種，煙曲霉其本身是被投放在湖水中，已證明結果較為安全[16]。從果樹本身角度看，煙曲霉作為植物內生菌群之一，在正常生長的農作植物中能夠分離得到煙曲霉[17]。果樹生產環境相對開放，并且在煙曲霉在植株生長中并未有明顯的毒害作用，同時作為非靶生物的人和牲畜一般認為是在低抵抗力的情況下受到煙曲霉孢子侵犯得病[18]，使得煙曲霉在果樹生產上的安全利用存在可操作性。

2?農作物秸稈再利用

2.1?煙曲霉的馴化和保存

煙曲霉對農作物秸稈生物轉化能力比較強，可采用菌株馴化篩選的方法[19]，將察氏固體培養基中的碳源蔗糖（或葡萄糖）按比例逐步兌換為果樹秸稈粉，將最后用純農作物秸稈粉培養的煙曲霉作為種子培養基，培養基其他成分可采用察氏固體培養基配方，進行至少90 d的固體培養。當固體培養基至瓶內顏色開始出現青色時，將其作為原菌種封口冷凍保存。

2.2?煙曲霉的擴大培養

活化的固體培養基可以轉接菌絲和基質到裝有培養液，培養液成分除瓊脂外與種子培養基保持一致，參考條件控制在30 ℃以上，轉速120 rpm以上，培養至少30 d以上，以獲得母液。培養初期液體培養基呈白色或淡黃色，菌體形狀不規則但明顯，隨著培養時間增加，色素慢慢累積呈青綠色，培養基液體顏色也呈現黃色。通過母液多批次接種獲得成規模煙曲霉培養液，每批次培養至少30 d以上，待菌團或菌絲變大變多后，采用3層紗布過濾獲得。

2.3?煙曲霉的性狀特點

將煙曲霉用水稀釋800～1 000倍，制得煙曲霉，現配現用。該制劑呈淡黃色，包含煙曲霉孢子、菌絲體和秸稈顆粒等不溶物。煙曲霉中代謝產物主要活性成分為小分子生物堿[20]和有機酸[21]，因此可通過紫外-可見光分光光度計測定總生物堿[22]和有機酸[23]的含量。

3?潛在應用價值

3.1?增加土壤肥力

煙曲霉可以以農作物秸稈粉為底物，煙曲霉發酵得到代謝產物。煙曲霉的原料底物秸稈中含有碳、氮、磷、鉀等元素，通常情況下纖維素、半纖維素和木質素難以短時間降解，并且若直接在田間腐熟，未完全腐熟情況下容易產生大量病菌和蟲卵;煙曲霉能產生多種酶，如纖維素酶、木聚糖酶、淀粉糖化酶和β-1，6-葡聚糖酶等，對稻草[24]、玉米[25]、棉[26]等果樹秸稈均能作為碳源利用和降解。

3.2?減少果樹病蟲侵害

煙曲霉中存在對稻瘟病、紋枯病或赤星病病原真菌有抑菌效果的生物堿和有機酸，包括煙曲霉酸、12β-羥基-13α-甲氧基黃霉素TR-2、震顫真菌毒素和煙曲霉震顫素B等，這些次生代謝產物在實驗室條件下的抗病效果均與廣譜殺菌劑多菌靈（Carbendazim）或惡霉靈（Hymexazol）相當[27]。另外，煙曲霉中存在煙曲霉誘導的胞外幾丁質酶，也可能產生意想不到的效果[28]。目前，商品化的幾丁質殺蟲劑Clandosan在美國已經應用于園藝植物。該產品宣傳可以促進土壤微生物產生一種殺死線蟲和蟲卵的幾丁質酶，以致殺滅根瘤線蟲（Meloidogyne spp.）[29]。而煙曲霉本身能夠分泌幾丁質酶，因此，施用煙曲霉在土壤中可能有直接防治害蟲或者與其他微生物協同防治的潛力。

3.3?降低果樹環境污染

煙曲霉中存在低劑量煙曲霉孢子和菌絲可能起到煙曲霉的生物降解作用。在實驗室條件下已經證明煙曲霉對甲胺磷[4]、阿特拉津[5]、西瑪津[5，6]等農藥有降解能力，并且能夠降解小分子聚乙烯薄膜殘體，在“光照+煙曲霉”綜合降解模式下可縮短農用薄膜的降解周期[7]。

4?展望

煙曲霉有毒次生代謝產物多為環境因素影響。比如在高濃度氯化鈉脅迫條件下，煙曲霉代謝大量產生膠毒霉素（Gliotoxin）[12]。一方面，通過去毒提取工藝和產毒機理研究，可以提高利用煙曲霉的安全性。如何讓煙曲霉本身減毒或是通過層析等分離方法將其去毒，這需要嘗試。比如采用兩步發酵制有機肥法，

第1步采用煙曲霉處理底物，第2步采用其他菌株處理煙曲霉代謝產物，這是一種很好的減毒探索方法[30]。再比如可以通過基因敲除、紫外誘變或抗性篩選尋找弱毒菌株，也是未來發揮高濃度煙曲霉高酶活和次生代謝產物的研究途徑。另一方面，稀釋倍數有利于避免微生物危險[31]，保證對環境相對親和，為田間試用提供實際操作的可能。煙曲霉基于生化特點，以往煙曲霉基本處于配角中，比如有機肥中添加適量煙曲霉發酵被認為是有助于制備新的生物有機肥[32];空氣中帶有煙曲霉孢子的混合菌種出現在我國某些傳統發酵工藝中如某些釀酒、豆豉、腐乳中[33]。煙曲霉與人類的關系密切，需要理性看待其危害，其本身的經濟價值尚待我們開發。

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