大鼠脊柱融合模型構(gòu)建及其應(yīng)用的研究進(jìn)展

劉 超，康 禹，晏怡果，王 程，王文軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科，湖南 衡陽 421001)

自20世紀(jì)初Hibbs[1]和Albee[2]開始將脊柱融合術(shù)應(yīng)用到臨床以來，脊柱融合術(shù)逐漸成為治療脊柱退行性疾病的重要手段，同時(shí)脊柱融合術(shù)的應(yīng)用也逐漸擴(kuò)展到脊柱畸形和脊柱創(chuàng)傷的治療當(dāng)中[3-4]。脊柱融合的定義是某兩個(gè)或者多個(gè)脊椎節(jié)段間經(jīng)植骨術(shù)后形成骨性連接[5]。盡管脊柱融合術(shù)的手術(shù)技術(shù)和器械在近些年來有很大的改進(jìn)，但常規(guī)后路腰椎間融合術(shù)融合失敗的發(fā)生率仍有2%～15%[6-7]；為對脊柱融合術(shù)的技術(shù)和相應(yīng)器械進(jìn)一步改良以提高融合率，眾多研究者通過構(gòu)建動(dòng)物模型來模擬人類脊柱融合的過程[8-9]。大鼠作為最常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，與其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，具有傳代時(shí)間短、價(jià)格便宜、在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下容易飼養(yǎng)等優(yōu)勢，近年來脊柱融合相關(guān)研究也開始采用大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，本文就大鼠脊柱融合模型的構(gòu)建及其應(yīng)用展開綜述。

1 大鼠脊柱的局部解剖

大鼠的脊柱由57-60枚椎骨相連而成，整個(gè)大鼠脊柱可分為5部分：頸椎7枚；胸椎13枚；腰椎6枚；薦椎4枚；尾椎27-30枚[10]。O’Connell等[11]測量了大鼠和其它幾種常用動(dòng)物模型椎間盤幾何參數(shù)，為了方便比較，所測得數(shù)據(jù)均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理：高度和前后徑長度均除以左右徑長度，面積除以左右徑長度的平方；分析發(fā)現(xiàn)大鼠腰椎和小鼠尾椎椎間盤結(jié)構(gòu)參數(shù)與人類椎間盤較為接近。Jaumard等[12]利用Micro-CT技術(shù)對大鼠脊柱進(jìn)行掃描并測量了相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)的具體數(shù)據(jù)，引入橢圓度的概念將大鼠脊柱與人類脊柱進(jìn)行比較(橢圓度=左右徑/前后徑)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠腰椎椎體橢圓度與人類接近，而且兩個(gè)物種的頸椎和腰椎椎管橢圓度也是相似的，同時(shí)研究通過比較椎體高度與前后徑之比發(fā)現(xiàn)大鼠的椎骨尺寸變化較大，較人類脊柱在形態(tài)上顯得更為細(xì)長。

2 大鼠脊柱融合模型的構(gòu)建

2.1 大鼠橫突間融合模型

大鼠橫突間融合模型于1992年首次報(bào)道，Guizzardi等[13]采用該模型研究了異體脫鈣骨基質(zhì)的骨誘導(dǎo)活性。隨后，一些脊柱融合相關(guān)研究以此模型為基礎(chǔ)展開，2003年Grauer等[14]為研究胸腺缺失對脊柱融合的影響，在研究中采用了大鼠橫突間融合模型并詳細(xì)闡述了此動(dòng)物模型的構(gòu)建方法：選取合適的節(jié)段(L4/5)，經(jīng)后路正中切口充分暴露橫突和小關(guān)節(jié)的外側(cè)表面，刮除橫突表面皮質(zhì)骨，然后在橫突間植入自體骨；通過人工觸診(L4/5節(jié)段無活動(dòng)則判定為融合成功)以及組織切片染色驗(yàn)證該模型的成功構(gòu)建，同時(shí)提出大鼠的脊柱融合觀察時(shí)間應(yīng)不少于6周。后續(xù)一些學(xué)者繼續(xù)采用該模型進(jìn)行相關(guān)研究：Koerner等[15]構(gòu)建大鼠橫突間融合模型繼續(xù)深入探究植骨處的細(xì)胞因子及生長因子的表達(dá)情況；Ryu等[16]和Son等[17]則是在此模型上展開研究，闡述了激活素A/BMP-2(activin A/BMP2 chimera，AB204)嵌合體對骨融合的影響。大鼠橫突間融合動(dòng)物模型構(gòu)建的手術(shù)時(shí)間短、創(chuàng)傷小，動(dòng)物的存活率高、術(shù)后并發(fā)癥少[18]；但此模型的主要缺點(diǎn)是由于之前的造模方式中融合節(jié)段并沒有使用內(nèi)固定，融合率往往偏低。

2.2 大鼠椎體間融合模型

除橫突間融合模型以外，國內(nèi)外研究學(xué)者還通過大鼠椎體切除或者椎間盤切除聯(lián)合植骨的方法構(gòu)建了椎體間融合模型。張兆飛等[19]利用手術(shù)植骨的方法成功構(gòu)建了大鼠椎體間融合模型，實(shí)驗(yàn)分3組(A組、B組、C組)：在成功切除尾1椎體后，A組植入0.3 cm3髂骨、B組植入0.2 cm3髂骨、C組不植骨，然后在上下相鄰椎體用磨鉆各鉆一個(gè)孔，安裝內(nèi)固定，3周后人工觸診初步評價(jià)融合情況：僅A組1只出現(xiàn)融合節(jié)段活動(dòng)受限；6周后再次人工觸診：只在A、B兩組出現(xiàn)融合節(jié)段活動(dòng)明顯受限(每組各4只)；進(jìn)而通過切片組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)A、B組已融合的標(biāo)本有骨橋形成，骨小梁互相連接，C組則未見新生骨組織形成。Okada等[20]則是為了研究重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)對骨融合的影響，成功構(gòu)建大鼠尾部椎間融合模型：切除第6/7尾椎水平椎間盤聯(lián)合椎間隙植骨進(jìn)行融合模型構(gòu)建。由于具有暴露方便、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，大鼠尾椎在大鼠椎間融合模型構(gòu)建中常被選擇，但是大鼠尾椎血供較差、容易感染也是該模型構(gòu)建失敗的常見原因。而Rousseau等[21]所提出的大鼠腰椎前路手術(shù)入路為大鼠椎體間融合模型的構(gòu)建提供了新的思路：取腹部正中切口，經(jīng)腹直接顯露大鼠腰椎，由于大鼠腹腔內(nèi)胃腸道沒有與腹壁背側(cè)相連，因此腹腔入路可以暴露大鼠的大部分腰椎，該項(xiàng)研究為大鼠前路腰椎融合模型提供了解剖學(xué)基礎(chǔ)。隨后Damle等[22]對該造模方法的可行性進(jìn)行了更加深入的評估：在左側(cè)輸尿管之間和下腔靜脈之間進(jìn)行鈍性分離，將下腔靜脈推到右側(cè)，把橫穿腰大肌的髂腰靜脈結(jié)扎可以有效避免術(shù)中血管損傷和輸尿管損傷，術(shù)中盡量避免損傷腰叢神經(jīng)，降低術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。以上兩位學(xué)者的研究利用腰椎前路手術(shù)入路構(gòu)建大鼠椎體間融合模型具有可行性，且該入路更加貼近臨床實(shí)踐。

3 大鼠脊柱融合模型的評價(jià)方法

大鼠脊柱融合模型構(gòu)建成功與否，需要有相應(yīng)的評價(jià)方法來做進(jìn)一步驗(yàn)證，目前主要有人工觸診、影像學(xué)和組織學(xué)等多種方法。在小動(dòng)物融合模型中，人工觸診作為傳統(tǒng)的評價(jià)方法，其操作簡單：即徒手測試標(biāo)本屈伸狀態(tài)的受限程度，研究報(bào)道其靈敏度優(yōu)于X線[23]，因而在研究中被廣泛采用。此外，一些新技術(shù)也被用于融合評價(jià)當(dāng)中來，Robinson等[24]設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有微型傳感器的液壓裝置，對融合節(jié)段的剛度(剛度=力矩/位移)進(jìn)行測試，從而評價(jià)該節(jié)段的融合情況。放射學(xué)檢查評估包括X線[19,25]和Micro-CT[16-17,26-30]，X線需結(jié)合數(shù)值分級系統(tǒng)方能進(jìn)行融合分級(表1)；Micro-CT則可以重建出直觀的三維圖像：分析三維骨小梁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確的描述新骨形成的微觀情況，并且可以得到準(zhǔn)確的融合相關(guān)參數(shù)：骨體積/組織體積(Bv/Tv)、骨小梁厚度(Tb.Th.)、骨小梁數(shù)量(TB.N)和骨小梁間距(Tb.Sp)等，是目前評估骨融合、骨重建的重要手段。上述方法都是通過檢查間接評價(jià)模型的融合情況，在評價(jià)模型是否發(fā)生成骨融合時(shí)，最終仍需要進(jìn)行組織學(xué)檢查，通過切片、染色對骨組織進(jìn)行鑒定、觀察，配合相應(yīng)圖片處理軟件對骨組織進(jìn)行定量分析，從組織學(xué)層面評價(jià)局部的骨融合情況[16-17,25-29]。

表1 放射學(xué)評分系統(tǒng)[21]

4 大鼠脊柱融合模型的應(yīng)用

目前脊柱融合手術(shù)仍然有一定的融合失敗率，因此一些研究以大鼠脊柱融合模型作為載體，圍繞著提高脊柱融合率展開研究，探討各種生物制劑對骨融合的影響。Koerner等[15]在大鼠橫突間融合模型的手術(shù)節(jié)段局部使用不同劑量的rhBMP-2進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在術(shù)后早期(1 h和6 h)高劑量組(100 μg)大鼠的白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑表達(dá)較高，而血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子、血小板衍生生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子均表達(dá)較低，由此推論大劑量rhBMP-2可上調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而加重炎癥反應(yīng)，影響骨質(zhì)愈合。Ryu等[16]利用大鼠橫突間融合模型發(fā)現(xiàn)與rhBMP-2相比，局部應(yīng)用A/BMP-2(activin A/BMP2 chimera，AB204)嵌合體的大鼠融合骨量和血清骨鈣素較高，表現(xiàn)出了更好的成骨活性；而Son等[17]利用去勢大鼠橫突間融合模型也得到了相似的結(jié)果，提出在脊柱融合中AB204可作為rhBMP-2的良好替代品。Ishida等[26]通過在構(gòu)建大鼠橫突間融合術(shù)中局部應(yīng)用萬古霉素和妥布霉素，發(fā)現(xiàn)術(shù)中超劑量使用萬古霉素雖然可以降低手術(shù)部位感染的發(fā)生，但是對脊柱融合質(zhì)量也產(chǎn)生了不利影響。

近年來仿生支架相關(guān)研究已經(jīng)成為骨科領(lǐng)域的熱點(diǎn)，也有一些研究采用大鼠脊柱融合模型進(jìn)行仿生支架成骨研究。Liao等[27]設(shè)計(jì)了一種膠原/β-磷酸三鈣/羥基磷灰石復(fù)合載體，結(jié)合富含血小板血漿，在大鼠橫突間融合模型上展開研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植入富含血小板的復(fù)合載體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組融合情況明顯優(yōu)于其它組，其橫突間觀察到有較多骨小梁連接，而其余組僅見膠原纖維組織填充其中，由此得出結(jié)論：該種膠原/β-磷酸三鈣/羥基磷灰石復(fù)合載體結(jié)合富含血小板血漿對大鼠腰椎融合具有促進(jìn)作用。Salamanna等[28]采用羥基磷灰石仿生支架構(gòu)建大鼠橫突間融合模型，并復(fù)合鍶或阿侖膦酸鹽進(jìn)行干預(yù)，8周后進(jìn)行Micro-CT掃描，發(fā)現(xiàn)復(fù)合鍶或阿侖膦酸鹽的兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁厚度明顯高于單純支架組，其骨小梁數(shù)量更多、骨小梁間距也更為密集。Lin等[29]研制出一種結(jié)合了丹酚酸B(salvianolic acid B，SB)的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA/β-TCP)復(fù)合支架，并應(yīng)用于大鼠橫突間融合模型，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組骨體積比分?jǐn)?shù)明顯高于單純支架組且與SB劑量呈正相關(guān)，CT血管造影顯示新生血管生成也與SB劑量成正相關(guān)，與自體植骨組相比骨形成參數(shù)并無顯著差異，得出結(jié)論：加入SB的PLGA/β-TCP支架可以通過促進(jìn)成骨和血管生成來促進(jìn)骨融合。

5 總結(jié)與展望

大鼠脊柱融合模型具有手術(shù)操作相對簡單、動(dòng)物容易飼養(yǎng)和觀察周期短等優(yōu)勢，為研究脊柱融合這一臨床重要問題提供了一種可行的動(dòng)物模型。然而目前該模型也存在諸多不足之處，表現(xiàn)尤為突出的是模型的臨床仿真度仍有不足，例如橫突間植骨后無內(nèi)固定、椎體間植骨多采用尾椎模型而不是腰椎模型、建模后大鼠脊柱缺少軸向應(yīng)力刺激等。綜上所述，通過改進(jìn)模型制備方法更加貼近臨床手術(shù)或術(shù)后誘導(dǎo)大鼠站立予以軸向應(yīng)力刺激等，將構(gòu)建出更為貼近臨床實(shí)踐的大鼠椎間融合動(dòng)物模型，從而更好地服務(wù)于臨床基礎(chǔ)研究。