血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP聯合對非小細胞肺癌的診斷價值

王 娟，潘 鑫，徐永茂

(陸軍第七十一集團軍醫院 1. 血液內分泌科,2.腫瘤血液科,江蘇 徐州 221009)

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因[1]，5年生存率低于15%[2]。肺癌中約85%為非小細胞肺癌[3]。診斷生物標記物的使用可以幫助識別早期非小細胞肺癌患者，無創且易于評估的液體活檢成為新生物標志物的來源[4]。外泌體是衍生自多囊泡體的小膜囊泡，通過胞吐作用將其組成性地或在細胞活化后釋放到細胞外空間中[5]。外泌體包含來自其起源細胞的生物活性物質，包括核酸和蛋白質，并且已經表明它們可能在細胞間通訊中發揮作用[6]。Sandfeld-Paulsen B等人[7]通過蛋白質組學發現非小細胞肺癌患者血清外泌體內紐約食管鱗狀細胞癌抗原-1(New York-esophageal-1,NY-ESO-1),Alix,胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)的表達水平明顯高于健康志愿者。但是血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP是否能夠應用于非小細胞肺癌患者的診斷仍需探索。本文針對上述三種標記物在非小細胞肺癌患者的診斷中的價值進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年2月至2020年2月本院收治的早期非小細胞肺癌(Ⅰ期和Ⅱ期)患者100例為肺癌組；男65例，女35例；年齡27～68歲；平均年齡(52.53±24.64)歲。納入同期本院收治的肺部良性患者100例作為良性組；男61例，女39例；年齡34～81歲；平均年齡(55.32±23.05)歲。其中，肺炎性假瘤50例，間質性肺炎22例，肺結核10例，肺膿腫8例，鈣化結節5例，炎性結節5例。非小細胞肺癌患者100例和肺部良性疾病患者100例均經本院診斷證實。排除標準：①嚴重心、肝、腎功能損害者；②長期使用皮質類固醇激素及免疫抑制劑者；③患有精神疾病者；④患有其他癌癥者。同時，納入同期在本院體檢的健康者100例為對照組；男64例，女36例；年齡33～79歲；平均年齡(54.65±26.10)歲。各組一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 外泌體的分離和蛋白的檢測

采取早期非小細胞肺癌患者、肺部良性疾病患者、體檢健康者的清晨肘前靜脈血6 mL。使用廣州捷威斯生物科技有限公司的外泌體純化試劑盒(BB-3951-1)進行外泌體的分離。將分離的外泌體超聲破膜后，以酶聯免疫吸附試驗檢測NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達量。以CD63作為內參。CD63檢測試劑盒購自廣州杰特偉生物科技有限公司(貨號：E9307h)。NY-ESO-1檢測試劑盒購自北京啟維益成科技有限公司(貨號：abx433062)。Alix檢測試劑盒購自北京百諾威生物科技有限公司(貨號：ABC1435)。PLAP檢測試劑盒購自上海機純實業有限公司(貨號：ml000475)。

1.3 統計學分析

SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料滿足方差齊性和正態分布，多組間比較采用one-way ANOVA檢驗。應用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析NY-ESO-1,Alix,PLAP檢測非小細胞肺癌的臨床診斷價值。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平

三組受試人員血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平存在顯著差異(P<0.05)，且NY-ESO-1,Alix,PLAP分別在肺癌組中的表達高于良性組和對照組，良性組又高于對照組，說明血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平與腫瘤的惡性程度有關，見表1。

表1 三組受試者血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平 (ng/L)

2.2 早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

為了評估血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP在早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者中的診斷價值，繪制100例早期非小細胞肺癌患者和100例肺部良性疾病患者的ROC曲線(圖1)。NY-ESO-1的陽性臨界值189.1(ng/L)，其診斷靈敏度為98%，特異度為78%；以Alix的陽性臨界值633.1(ng/L)，其診斷靈敏度為95%，特異度為80%；以PLAP的陽性臨界值45.42(ng/L)，其診斷靈敏度為90%，特異度為90%。Alix曲線下面積大于NY-ESO-1和PLAP，說明就單向診斷而言，早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者血清外泌體中Alix診斷的效能高于NY-ESO-1和PLAP。見圖1和表2。

圖1 早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

2.3 早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

為了評估血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP在早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者中的診斷價值，繪制100例早期非小細胞肺癌患者和100例健康體檢者的ROC曲線(圖2)。以NY-ESO-1的陽性臨界值91.03(ng/L)，其診斷靈敏度為95%，特異度為95%；以Alix的陽性臨界值367.8(ng/L)，其診斷靈敏度為94%，特異度為95%；以PLAP的陽性臨界值7.197(ng/L)，其診斷靈敏度為95%，特異度為92%。NY-ESO-1曲線下面積大于Alix和PLAP，說明就單向診斷而言，早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者血清外泌體中NY-ESO-1診斷的效能高于Alix和PLAP。見圖2和表3。

圖2 早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

表2 早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

表3 早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

2.4 血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP對非小細胞肺癌的聯合診斷

患有非小細胞肺癌的為真陽性，未患有非小細胞肺癌的為真陰性。以NY-ESO-1的陽性臨界值189.1(ng/L)、Alix的陽性臨界值633.1(ng/L)、PLAP的陽性臨界值45.42(ng/L)為診斷界限，三者全滿足者為聯合診斷陽性。血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP聯合對非小細胞肺癌的診斷的的靈敏度為95.00%(95/100)，特異度為91.00%(182/200)，準確度為92.33%(277/300)。見表4。

表4 血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP對非小細胞肺癌的聯合診斷

3 討 論

肺癌是全球最常見、最致命的惡性腫瘤[8]。其中，非小細胞肺癌患者占85%，其中5年度生存率仍僅為15%。根據每年的低劑量計算機X線攝影篩查進行的國家肺癌篩查試驗表明，識別早期肺癌個體有降低死亡率的潛力。但在鑒別良惡性病變有一定的局限性，并且定期進行放射線暴露可能會造成有害影響[9]。因此，開發特異性和非侵入性生物標志物測定對于提高高危人群的識別至關重要肺癌。在本研究中，分離血液中的外泌體后通過酶聯免疫吸附實驗檢測其中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平，使用ROC曲線分析發現血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP聯合鑒別早期非小細胞肺癌診斷的靈敏度為95.00%，特異度為91.00%，準確度為92.33%。約登指數是評價篩查試驗真實性的方法，其數值越大說明篩查實驗的效果越好，真實性越好。通過ROC曲線，發現NY-ESO-1,Alix,PLAP的約登指數均大于0.75，說明具有較好的真實性。本研究聯合診斷的標準是血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達量均達到陽性臨界值才判斷為聯合診斷陽性，而單個指標的靈敏度和特異度為僅滿足自身的陽性臨界值，因此聯合檢測組數據都小于NY-ESO-1,Alix,PLAP的單個指標值。盡管NY-ESO-1,Alix,PLAP均能夠作為非小細胞肺癌的潛在標志物，但是其在其他疾病患者的血清外泌體中是否也表達異常仍然未知。如果其它疾病的生物標志物是這三者之一，單個指標的診斷就會有假陽性的結果產生。因此，三者均達到陽性臨界值的聯合診斷能夠減少假陽性的產生。

最近有關外泌體的研究表明它們可能充當癌癥的生物標志物。在肺癌中已經研究了它們作為診斷性生物標志物的用途[10]。然而，僅在少數針對細胞外囊泡或外泌體miRNA的小型研究中評估了外泌體作為預后標志物的用途[11]。外泌體表面蛋白很可能反映了非小細胞肺癌的病理過程，但是以往的研究尚未研究過外泌體中蛋白的診斷潛力。本研究通過分離受試人員外泌體發現，3組受試人員血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平存在顯著差異(P<0.05)。提示外泌體中的蛋白具有診斷潛力。

NY-ESO-1是在許多實體癌中表達的睪丸癌抗原[12]。有研究評估了非小細胞肺癌組織中NY-ESO-1的基因表達，發現它存在于15%～30%的肺癌樣本中[13]。Alix，也稱PDCD6IP，在胞質分裂的脫落階段，腔內內體囊泡形成和包膜病毒出芽中在ESCRT途徑內起作用[14]。Liu SG等[15]發現在中國漢族人群中，Alix與非小細胞肺癌風險相關。研究表明，這種蛋白的過度表達可以阻止細胞凋亡[16]。因此，PDCD6IP可能在包括NSCLC在內的癌癥發展中起關鍵作用。PLAP是一種催化磷酸單酯水解的金屬酶[17]。Wick MR等[18]發現PLAP在女性苗勒氏癌，腸癌和肺癌中異常表達。本研究發現血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP鑒別早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者的靈敏度分別為98%、95%和90%，特異度分別為78%，80%，90%。血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP鑒別早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者的靈敏度分別為95%，94%，95%，特異度分別為95%，95%，92%。因此，推測血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP對早期NSCLC具有較好的診斷作用。

綜上所述，血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達量檢測可作為診斷早期非小細胞肺癌的潛在標志。