藍白斑聯合Sanger測序技術檢測KRAS基因12位密碼子突變

溫博雅,彭翠英,徐 暢,周翠蘭*

(1.南華大學衡陽醫學院,湖南 衡陽 421001;2.南華大學衡陽醫學院應用解剖學與生殖醫學研究所，湖南 衡陽 421001;3.生態健康與人類重要疾病防控湖南省高校重點實驗室，湖南 衡陽 421001;4.生物毒理與生態修復衡陽市重點實驗室，湖南 衡陽 421001;5.有色金屬礦區耕地重金屬污染生態阻抗技術研究衡陽市重點實驗室，湖南 衡陽 421001)

Kirsten大鼠肉毒病毒原癌基因同源基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)突變與多種腫瘤的發生相關[1]。KRAS突變以點突變為主，而其中最常見突變為12位氨基酸突變[2]，其次為13位氨基酸突變。KRAS基因點突變與否與腫瘤的大小，類型及手術后是否復發相關[3]。在腫瘤的發生發展過程中，脫落的癌細胞與原發腫瘤組織癌細胞凋亡與壞死導致循環血液游離DNA含量增加[4]。經典的藍白斑篩選原理認為，當外源DNA與含lacZ的載體連接時，會插入載體的多克隆位點(MCS)，使載體α肽鏈讀碼框破壞，此重組質粒不表達α肽鏈，導入宿主缺陷菌株不能產生活性β-半乳糖苷酶，不可分解培養基中的X-gal，培養表型呈現白色菌落。有文獻報道[5]，當插入不含終止密碼子的3N核苷酸片段(N<34)時，含插入片段的重組載體其α肽鏈讀碼框沒有被破壞，能產生活性β-半乳糖苷酶，因而形成藍色菌落;相反，當插入含終止密碼子的3N核苷酸片段(N<34)時，由于其α肽鏈讀碼框因終止密碼子的存在而遭到破壞，因此不能產生活性β-半乳糖苷酶，則形成白色菌落。本文模擬游離DNA，采用“藍白斑篩選+酶切鑒定+Sanger測序”對KRAS基因12位密碼子熱點突變進行檢測，以探討此技術在檢測稀發基因突變中的可行性，為腫瘤相關的部分體細胞基因突變檢測提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

PCR儀為朗基公司(中國杭州)生產，A200型。E Coli. DH5α菌株為天根(北京)生產，PspGI、BamHI、HindIII、PMD-19T為TaKaLa公司(大連)產品。質粒DNA提取試劑盒、100 bp DNA Ladder、dNTP、MixTaq、DNA Polymerase、T4連接酶均為Thermo Scientific產品。IPTG、X-gal、Tris-bas等試劑購于佳和生物(長沙)。

1.2 引物設計與合成

根據腫瘤體細胞突變數據庫(COSMIC)提供的KRAS基因12位密碼子熱點突變及NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)提供的KRAS基因序列，利用引物設計軟件Premier 5.0設計引物S1(正向引物)、S2(反向引物)與S3(正向引物)。S1序列為5′-GTTAGCCAAGCTTTGACTGCATACAAACTTGT-3′，S2序列為5′-CGTCAGGATCCTTGGACCATATTCGTCCACA-3′，S3序列為5′-GTTAGCCAAGCTTTGACTGCATACAAACTTGTGGTAGTTGGAC-3′，其中S3中3′的C為引入的PspGI酶切序列的C。S1與S2擴增得到產物雙酶切后用于克隆，雙酶切后獲得的插入片段長度為102 bp，插入片段的長度為3的倍數(3N)。S2與S3擴增得到的產物用于酶切鑒定，所有引物序列由上海生工合成。

1.3 藍白斑篩選檢測混合質粒的PCR擴增產物

測定WT野生型與M12突變型質粒的OD值。M12突變型/WT野生型質粒分別以1∶30，1∶100，1∶300，1∶1 000的比例進行混合，WT野生型質粒最終濃度為2 ng/μL。以混合質粒為模板進行PCR擴增。PCR反應體系如表1所示。

表1 PCR反應體系

PCR擴增條件：預變性95 ℃ 1 min；變性95 ℃ 20 s，退火58 ℃15 s，延伸72 ℃20 s，共35 cycles；終延伸72 ℃ 5 min。

HindIII和BamHI酶切PMD-19T與PCR產物，瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化回收PCR產物與線性化載體，紫外分光光度計測定OD值。

PCR產物與載體連接。反應體系為10 μL，使插入片段含量為70 ng,載體的含量為20 ng,0.5 μL的T4 DNA Ligase，1 μL的10×T4 DNA Ligase Buffer。22 ℃反應30 min。將連接后的產物轉化至E Coli. DH5α菌株。培養物涂抹于含有X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上，瓊脂平板置于二氧化碳培養箱(5%)37 ℃培養15 h，觀察結果并挑白色克隆進行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性的克隆進行Sanger測序。

2 結 果

2.1 質粒序列

2.1.1 重組質粒序列 M12突變型質粒與WT野生型質粒為本實驗室構建[6]，插入片段的長度均為3的倍數的核苷酸長度(3 N),M12突變型質粒其TGG突變成TGA,序列見圖1。

圖1 質粒DNA序列圖A:WT野生型質粒插入片段序列；B:M12突變型質粒插入片段序列

2.1.2 質粒引入酶切位點 采用引物S2與S3，以WT野生型質粒與M12突變型質粒為模板，引入PspGI酶切位點。WT野生型質粒的PCR產物含酶切位點，M12突變型質粒的PCR產物不含酶切位點。將PCR產物送金唯智測序，其序列圖見圖2。

圖2 WT野生型與M12突變型質粒引入酶切位點測序圖A：野生型質粒引入酶切位點后的測序圖；B：M12突變型質粒引入酶切位點后的測序圖

2.2 藍白斑篩選檢測KRAS基因12位密碼子稀有突變

2.2.1 藍白斑篩選技術檢測稀有突變 如圖3瓊脂培養皿中長出了明顯可見的白色克隆與藍色克隆，證明藍白斑技術能夠檢測KRAS基因12位密碼子熱點突變。通過改變閱讀框架，當插入長度為3N的野生型片段至線性化載體，其閱讀框架不含終止密碼子，產生藍色克隆。長度為3N的突變型片段插入線性化載體，其閱讀框架含終止密碼子TGA，產生白色克隆。

圖3 藍白斑檢測KRAS基因稀有突變的克隆形成圖a,b,c,d分別為M12/WT的比例為1∶30,1∶100,1∶300,1∶1 000的克隆形成圖

2.2.2 藍白斑菌落計數 不同比例混合模板的PCR產物與載體連接后，轉化，接種到瓊脂培養基上，計數藍白菌落數量(表2)，藍白菌落數比值高于M12突變型質粒/WT野生型質粒比值，此可能為藍白斑篩選技術的假陽性造成。

2.2.3 白色菌落測序鑒定 在1∶1 000瓊脂培養板上挑取4個白色菌落，通過引入PspGI酶切位點的引物進行菌液PCR擴增、酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到2個陽性克隆(圖4)，即為突變型克隆，隨后采用Sanger測序對插入片段的序列進一步驗證。由于野生型擴增片段含有PspGI酶切位點，其擴增產物消化為更短的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳中檢測不出消化后的產物片段。

表2 不同比例M12突變型質粒/WT野生型質粒混合轉化培養后菌落計數 (個)

圖4 菌液PCR產物酶切電泳圖

2.2.4 測序驗證酶切鑒定陽性克隆 酶切鑒定為陽性的2個克隆，搖菌，提取質粒，送金唯智測序。經BLAST比對，為KRAS基因12位密碼子突變型片段(圖5)。結果提示藍白斑篩選與Sanger測序相結合，可以檢測出千分之一的突變，且能夠消除藍白斑篩選造成假陽性的缺點。KRAS基因野生型片段的基因型為TGG，突變型片段的基因型為TGA(圖5)。

圖5 陽性克隆測序結果紅框內標注的為突變序列TGA，其相對應的野生型序列為TGG

3 討 論

COSMIC數據庫是最大的癌基因數據庫，在數據庫及文獻中查詢得知KRAS基因12位密碼子突變是肺癌、胰腺癌、結直腸癌、子宮內膜癌等腫瘤中最常見的突變之一[2,7]。眾所周知，腫瘤的發生發展卷入了相關基因突變等分子事件，因此對腫瘤進行早期的分子診斷為預防與治療腫瘤顯得尤為重要[8-10]。

當今有關腫瘤分子篩查技術層出不窮，但是這些技術均存在一定的技術局限，使其不能在臨床上普及使用[11]。如熔點曲線具有高靈敏度，不需對后續的PCR進行處理，但并不是所有的突變都會有熔點曲線的變化[12-13]。位點特異性PCR靈敏度高，但有假陽性[14-15]。高保真聚合酶ON-OFF分子開關靈敏度高，同樣也有假陽性[16]。在眾多的方法中,測序分析是基因突變檢測的金標準[17]。基因測序，包括Sanger測序(一代測序)與高通量測序(二代測序)這兩種方法。當突變超過15%時，幾乎所有的相關技術都可用于此類標本的檢測，最為臨床接受的方法為Sanger測序[17-18]。當突變高于1‰時，可以采用高通量測序進行突變分析[18-21]。高通量測序雖然更適合于腫瘤切除術后監控與靶向用藥，但是高通量測序費用高，設備昂貴，數據分析復雜，不能在基層醫院普及。Sanger測序雖然費用低廉，但是其檢測突變靈敏度應在15%以上[18-19]，這限制了Sanger測序在基層醫院用于早期癌癥診斷的普及。

本實驗通過人工合成模板按比例混合模擬游離DNA，采用藍白斑篩選聯合Sanger測序技術，對KRAS基因12位密碼子突變進行檢測，可以達到千分之一的靈敏度。藍白斑篩選技術具有高效性的優點，假陽性的缺點。利用藍白斑技術的高效性可以克服一代測序技術對稀有突變檢測低靈敏度的缺點，這兩種技術相結合能相互揚長避短。實驗挑取特定顏色的陽性克隆進行酶切鑒定，再挑取陽性克隆進行Sanger測序，對插入片段進行驗證。通過藍白斑篩選、酶切與一代測序相結合對突變進行分析，結果顯示此方法可以成功檢測KRAS基因12位密碼子熱點突變。本研究所采用的方法可以用于對臨床標本游離DNA進行KRAS基因12位密碼子熱點突變檢測。此方法有一些潛在的優點，首先，作為一種無創性檢測，被患者接受的概率較高；其次，本方法只需簡單的設備及常規的分子生物學試劑，本技術操作方便，技術門檻低，可以在基層醫院推廣普及；第三，此方法檢測成本低，檢測費用低，普通百姓有能力支付相關檢測費用。通過此方法對腫瘤切除術后的患者血中游離DNA進行監測，可以為患者的預后提供腫瘤基因改變的信息，以指導臨床治療；同時，利用這一原理開發更多實用的突變檢測方法，未來有可能用于對臨床檢測疑似癌癥患者的篩查或具有癌基因家族的個體進行預防性的早篩。

綜上所述，本實驗通過藍白斑篩選、酶切與一代測序技術相結合，利用人工模板模擬游離DNA對KRAS基因12位密碼子熱點突變進行檢測，可以達到千分之一的靈敏度，且無假陽性。實驗結果提示通過對腫瘤突變基因循環cDNA進行藍白斑篩選并結合一代測序，可以使基因突變檢測達到更高的靈敏度，此方法適應于可轉化為終止密碼子的體細胞基因突變檢測。通過調整閱讀框架使之變為終止密碼子，可以采用此技術進行檢測。藍白斑篩選與一代測序技術結合優劣互補，它們的結合使用可成為一種高效、靈敏、特異、經濟、無創傷性的稀有基因突變檢測新方法，可能具有廣闊的市場應用前景。