PCDH8基因甲基化在診斷甲狀腺乳頭狀癌的價值

謝小紅，蔡偉奕，聶芙蓉，魏洪發，劉 丹，寧 潔

(深圳市龍華區中心醫院內分泌科，廣東 深圳 518110)

自從食鹽加碘政策實行以來，缺碘性甲狀腺腫發生率已經顯著下降，但整體的甲狀腺疾病患病率仍高達30%以上，目前甲狀腺癌已成為代謝內分泌科中最常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%，其全球發病率均呈上升趨勢[1-2]。這其中又以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinomas，PTC)發病率增長為主，約占成人的70%及幾乎兒童的全部，PTC生長緩慢，預后最好，但易發生早期淋巴結轉移及術后復發。目前國內外對PTC相關基因的研究常見的有：CK19、34BE12、HBME-1、VEGF、PTEN、Survivin、COX-2、Galectin-3、TPO、RET等[3-6]。眾多研究結果顯示這些腫瘤相關基因在PTC的診斷與鑒別診斷方面具有一定的價值。探討PTC的發生機制，尋找特異性腫瘤標志物，對于PTC的早期診斷、治療和預后具有非常重要的現實意義[7]。

原鈣粘蛋白8(protocadherin8，PCDH8)是黏附素蛋白家族中最大的亞家族—原鈣黏附素的家族成員[8]。近年研究發現，DNA的甲基化引起的表觀遺傳沉默與腫瘤的發生發展有密切的關系，而甲狀腺乳頭狀癌在基因DNA甲基化相關研究仍不多，本研究探討PCDH8基因的DNA甲基化及其對PTC診斷價值及應用前景。

1 材料與方法

1.1 數據庫分析

本研究采用從癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)網站(https://www.cancer.gov/)下載得到的相關數據集，入選樣本采用統一的標準：(1)甲狀腺癌患者經病理確診；(2)預后隨訪資料及臨床資料完整。最終確定了565名甲狀腺癌患者。下載數據集包括：(1)甲狀腺癌的臨床預后數據；(2)基于TCGA網站獲得PCDH8基因上20個不同cg位點的甲基化數據，PCDH8基因上每個cg位點的坐標基于UCSC Genome Brower GRCh37(圖1)。考慮到單個cg位點的甲基化水平難以代表基因的甲基化水平，我們用PCDH8基因20個cg位點的甲基化的β平均值代表PCDH8基因甲基化水平。β值通過公式β=U/(M+U+1)計算得到，其中U值為未甲基化探針的信號值，而M值為信號強度。

1.2 PCDH8基因甲基化位點選擇

從NCBI數據庫中檢索人源性PCDH8序列，設計引物時需將模板中的非CG位點的C轉換成T，且引物不能包含CG，后續采用巢式PCR擴增。外引物：PCDH8-mF 58.5:5′-GTTAAGGAAGTTTTTTTTGGTTTTTAG-3′，PCDH8-mR 57.3:5′-CCAACTCCTCTACATACAAAATACTAAC-3′；內引物PCDH8-F:5′-GG AAGTTTTTTTTGGTTTTTAGG-3′，PCDH8-R:5′-CCCC TCTAAACCTTTCCACTTA-3′

原始序列：GCTAAGGAAGTCTTCTCTGGTTTCCAGGTCGGGCGTCAGTCTCAGGCTCTCGGAATCACGCTCTTTGCGAGCCCTGTGCGGGAGAAGTCTGCGGGTAGCAGCTCCGAGCCTCCAGCGGGCTCTGAGGACGCGCGGACCCGCCCTCACTCTGCGCCTCTCCGTCTCTTACAGAAGCTGCGCCGCCTCGCGCCGCCTTTGCCTTTATAGCCGCCGATATGCTAATCACCCGAGCCGGGTAGCCAATGGCCGCCTCCCCCTCGCGTCGCCCCTCCGCCTGCCTCTGACAA；轉化后序列：GTTAAGGAAGTTTTTTTTGGTTTTTAGGTCGGGCGTTAGTTTTAGGTTTTCGGAATTACGTTTTTTGCGAGTTTTGTGCGGGAGAAGTTTGCGGGTAGTAGTTTCGAGTTTTTAGCGGGTTTTGAGGACGCGCGGATTCGTTTTTATTTTGCGTTTTTTCGTTTTTTATAGAAGTTGCGTCGTTTCGCGTCGTTTTTGTTTTTATAGTCGTCGATATGTTAATTATTCGAGTCGGGTAGTTAATGGTCGTTTTTTTTTCGCGTCGTTTTTTCGTTTGTTTTTGATAA

1.3 DNA提取步驟

通過Sanger技術分別檢測臨床病理標本甲狀腺乳頭狀癌組織33例、結節性甲狀腺腫組織30例、甲狀腺腺瘤組織42例及其癌旁正常樣本20例的PCDH8基因表達情況。DNA提取試劑盒：QIAgen FFPE DNA kit(50)石蠟包埋組織DNA純化試劑盒(50)貨號：No.56404。

將石蠟切片放于2 mL離心管中，向樣品中加入1 mL二甲苯進行石蠟溶解。向沉淀中加入1 mL無水乙醇，并通過震蕩混勻10 s，然后15 000×g離心2 min。將沉淀重懸于180 μL Buffer ATL和20 μL蛋白酶K，混勻渦旋震蕩。將離心蓋蓋緊，放于恒溫箱或水浴鍋中56 ℃孵育1 h，56 ℃孵育結束后進行90 ℃孵育1 h。90 ℃孵育結束后立即取出離心管，短暫離心，使液體聚集，置于室溫使其恢復到室溫。向樣品中加入200 μL Buffer AL，并通過渦旋充分混合。然后加200 μL無水乙醇，通過渦旋再次徹底混合。短暫離心，使液體聚集，將所有液體轉移至QIAamp MinElute柱。6 000 g離心1 min。將QIAamp MinElute柱置于新的收集管中，去除收集管，將吸附柱轉移到一個新的滅菌1.5 mL離心管中，向吸附柱加入20～100 μL Buffer ATE在膜的中央，同時覆蓋膜。蓋上蓋子室溫靜置1 min，然后20 000 g離心1 min，獲得DNA溶液。

1.4 重亞硫酸鹽轉化

1.4.1 重亞硫酸鹽緩沖液的配制 (1)使用微量稱量儀稱取0.033 g的C6H6O2(對苯二酚，生工，lot：RS0301B1013J)，移入2 mL的EP管中，加入雙蒸水使其定容到1.5 mL。上下顛倒溶解混勻，室溫放置;(2)使用微量稱量儀稱取2.375 g Na2S2O5(生工，lot：YK1204B2012J)，移入15 mL離心管中，加入雙蒸水使其定容到2 mL;(3)然后將步驟①和步驟②的溶液輕輕混勻，避免氣泡至完全溶解。加入雙蒸水定容至5 mL，混勻。

1.4.2 PCR擴增和測序 (1)取重亞硫酸鹽緩沖液處理基因組樣本DNA 1 μg至200 μL PCR管中，加入雙蒸水補齊10 μL。(2)加1.11 μL 3 mol/L的NaOH，程序設置為42 ℃ 20 min，95 ℃ 3 min，結束后立即放置冰上。(3)加89 μL上面配制的重亞硫酸鹽緩沖液，混勻，加兩滴石蠟油至液面。程序設置為55 ℃ 3 h；95 ℃ 3 min，55 ℃ 3 h，4個循環；4 ℃維持，后續將采用巢式PCR擴增、Sanger測序，特異位點甲基化率=(C/C+T)×100%。

1.5 統計學分析

對所有數據進行正態性檢驗，若服從正態分布數據以均數±標準差表示，若不服從正態分布，數據以中位數表示。服從正態分布的數據兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，否則采用Mann-WhitneyU非參數檢驗。用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，用Log-rank檢驗進行兩組或多組生存曲線的比較。統計檢驗均為雙側檢驗，P<0.05時差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 納入分析的人群基本特征及與PCDH8相關性分析

本研究從TCGA中共計納入615例樣本。其中515例為甲狀腺癌組織(病例組)，100例為癌旁組織(對照組)。男性患者116例，女性患者449例，297例患者確診時平均年齡為(47.19±15.81)歲，對PCDH8甲基化位點進行檢測發現cg07202976在甲狀腺癌患者中高表達。隨訪隊列中最長隨訪時間為5423天，有22例死亡，593例存活，11例失訪，中位生存期為957天。PCDH8甲基化水平高的患者其存活時間較甲基化水平低的患者短(圖1)。

2.2 與甲狀腺癌相關的cg位點

本研究用位于PCDH8基因的20個cg位點的β值的均值代表PCDH8甲基化水平，結果發現癌組織PCDH8基因甲基化水平高于癌旁組織(0.222±0.242 vs 0.202±0.210,P<0.01)。對PCDH8基因甲基化位點進行差異性檢驗，發現cg22763718、cg20366906、cg14950829、cg18002116的甲基化水平在甲狀腺癌組織與癌旁組織之間的差異具有統計學意義(表1)。

圖1 PCDH8各甲基化位點在甲狀腺癌患者中分析A：PCDH8各甲基化位點在甲狀腺癌患者中表達量；B：CDH8各甲基化位點在甲狀腺癌患者中差異性分析；C：生存曲線分析

表1 PCDH8基因的20個cg位點的β值的比較

2.3 臨床樣本PCDH8基因甲基化Sanger測序

本研究收集臨床樣本125例，病例80例，其中男性20例，女性60例，平均年齡(40.51+12.87)歲。甲狀腺乳頭狀癌樣本33例、結節性甲狀腺腫樣本30例、甲狀腺腺瘤樣本42例及其癌旁正常組織樣本20例。經Sanger測序發現，甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤患者PCDH8基因甲基化水平高于癌旁正常組織，差異具有統計學意義(t=2.325，P=0.034)(表2)。

表2 PCDH8基因在不同組織中的甲基化表達率 (%)

3 討 論

DNA甲基化是表觀遺傳學的主要修飾方式之一，與基因表達調控、胚胎發育調節、基因組印記、女性X染色體失活和細胞分化及增生等方面有密切關系。現有研究已證實，DNA的甲基化引起的表觀遺傳沉默在腫瘤的發生發展起重要的作用[9]。腫瘤細胞的甲基化特點表現為基因組DNA總體甲基化水平通常低于正常細胞，針對DNA甲基化對PTC相關基因進行檢測具有潛在的研究意義。

本研究對TCGA數據庫進行挖掘，初步發現PCDH8基因20個cg位點里面有4個位點甲基化水平在病例對照組之間存在差異。選擇位于PCDH8基因的20個cg位點的均值來代表其總體甲基化水平，發現癌組織PCDH8基因甲基化水平高于癌旁組織。我們對甲狀腺癌患者PCDH8基因甲基化水平與生存相關性分析，發現PCDH8基因甲基化水平越高的患者生存時間越短。我們同時對正常組織和癌組織的20個位點甲基化水平進行分析，發現PCDH8基因的cg22763718、cg20366906、cg14950829、cg18002116位點的甲基化水平與甲狀腺癌預后存在顯著關聯。

基于上述分析，我們于2017年8月至2019年3月收集甲狀腺乳頭狀癌樣本33例、結節性甲狀腺腫樣本30例、甲狀腺腺瘤樣本42例及其癌旁正常組織樣本20例。選擇上述差異性位點基因對樣本進行Sanger測序，結果顯示，甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤患者PCDH8基因甲基化水平顯著高于癌旁正常組織。

近幾年已經有研究發現PCDH8在某些腫瘤中基因組發生異常甲基化，導致PCDH8基因發生突變或表觀遺傳性沉默，而外源性表達PCDH8基因可抑制腫瘤細胞增殖和轉移，這些腫瘤包括結直腸癌、乳腺癌、袖套淋巴細胞瘤、腎細胞癌等[10]。PCDH8基因在某些胰腺癌細胞株上發生甲基化，而基因mRNA水平下降或消失也有被證實[11]。最近，研究已經證實PCDH8基因在胰腺癌細胞發生異常甲基化，并導致基因表達缺失，參與胰腺癌的發生發展過程，通過基因功能恢復，可能具有抑制腫瘤生長的作用，與國外研究結果類似[12]。

綜上所述，PCDH8作為新型抑癌基因參與了甲狀腺乳頭狀癌的發生發展過程，PCDH8基因甲基化水平對診斷甲狀腺乳頭狀癌具有重要意義。