E3 泛素連接酶接頭蛋白SPOP 抑制前列腺癌的研究進展

李 倩（綜述） 王 健 金曉鋒（審校）

（寧波大學醫學院生物化學與分子生物系-浙江省病理生理學技術研究重點實驗室 寧波 315211）

前列腺癌（prostate cancer，Pca）是第二常見的男性癌癥，全世界每年因Pca 死亡25 萬例［1］，病死率僅次于肺癌［2］。我國Pca 發病率低于西方國家，但隨著人口老齡化、飲食和生活習慣改變及血清前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）篩查等體檢技術的普及，Pca 發病率和病死率呈逐年上升趨勢［3］。

Pca 發病率和死亡率存在顯著的種族差異。在不同種族人群中，遺傳因素之間的獨特相互作用可能導致關鍵致癌/抑癌基因突變出現差異傾向［4-5］。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）發布的數據顯示，根據關鍵致癌/抑癌基因，75%的Pca 可分為7 個分子亞型：ETS家族基因融合（包括ERG、ETV1、ETV4或FLI1 基因），SPOP/CHD1、FOXA1和IDH1基因點突變，另25%的Pca 由其他未知的遺傳改變驅動［6-7］。

研究發現，10%～15%的Pca 患者中存在斑點型鋅指結構蛋白（speckle-type POZ protein，SPOP）基因的高頻突變［8］，SPOP突變與TMPRSS2-ETS基因融合互斥，機制可能是SPOP突變后無法降解原本受野生型SPOP 降解的底物，從而抑制TMPRSS2 -ETS融合形成［6，8-13］。這提示SPOP突變可能是早期Pca 發生的驅動事件，對SPOP基因結構和功能的研究有望為Pca 的發生發展、病理分型及分子靶向治療手段提供新思路。本文將從SPOP基因的結構與功能、Pca 中SPOP的突變情況、SPOP突變介導Pca 發生發展的具體分子機制，以及Pca 臨床精準靶向治療等方面對其研究進展作一綜述。

SPOP 蛋白的結構與功能SPOP 蛋白是Cullin3 家族E3 泛素連接酶的接頭蛋白，是MATHBTB 核蛋白家族成員之一。SPOP基因位于人染色體17q21.33 上，SPOP 蛋白由374 個氨基酸殘基組成，相對分子質量為42 000，主要結構域（圖1）包括N 端的底物結合結構域MATH（31～164 位氨基酸殘基）、與Cullin3 相互作用的BTB 結構域（184～297位氨基酸殘基）、3-box（300～327 位氨基酸殘基）和C 末端的核定位（NLS）序列（365～374 位氨基酸殘基）［14-15］。

圖1 SPOP 蛋白的結構及Pca中SPOP 基因高頻突變位點的示意圖Fig 1 The diagram of SPOP protein and the distribution of most comman mutation in the SPOP gene found in prostate

晶體學和小角度X 射線散射分析（small angle X-ray scattering，SAXS）數據表明，SPOP 結構最顯著的特征是MATH 結構域連接BTB/3-box 結構域，生成由2 個底物結合位點和2 個催化核心組成的二聚體泛素連接酶［15］。BTB 和3-box 結構域的協同二聚作用促進了線性的SPOP 二聚形成。由于這種特殊的線性二聚結構，SPOP 結構域可以募集底物并延長泛素鏈，使其靈活變動方向，從而獲得更高的親和力并和更多的構象選擇來介導泛素化。SPOP 通過MATH 結構域選擇性地募集底物，而其BTB 和3-box 結構域介導寡聚化，并與Cullin3 相互作用［16］，進而泛素化修飾底物，調控底物的蛋白質水平（泛素化降解）或者功能活性（非降解型泛素化修飾，圖2A）。研究發現SPOP 的底物參與各種基本的細胞功能活動，例如死亡結構域相關蛋白（death domain associate protein 6，Daxx）參與細胞轉錄、細胞周期和凋亡［17］；雄激素受體（androgen receptor，AR）參與細胞的信號轉導［18］；內質網（endiplasmic reticulum，ER）應激反應轉錄因子（DNA damage inducible transcript 3，DDIT3）在內質網應激時轉入細胞核內，調控凋亡基因的表達，維持細胞穩態［19］。因此正常功能的SPOP 在細胞周期、信號轉導和維持細胞功能穩態等過程中均起重要作用［20-22］。

2010 年在一項關于58 種腫瘤體細胞突變的研究發現，SPOP是Pca 的高頻突變基因［23］，且突變位點幾乎都集中于MATH 結構域。此后，大量研究發現Pca 來源的SPOP突變體通過兩種方式影響底物蛋白的功能。其一，突變的SPOP喪失結合底物的能力，使得促細胞生長的底物（如AR 蛋白）水平升高從而誘發Pca［24］（圖2C）。其二，野生型SPOP通常通過二聚體形式起作用，如果存在SPOP突變體，會影響正常二聚體的功能，進而破壞野生型SPOP 的蛋白功能（顯性負效應），例如SPOP突變體通過顯性負效應增加脊椎動物formin 蛋白（inverted formin-2，INF2）在內質網中的定位，促進線粒體分裂，這種線粒體分裂參與Pca 細胞的遷移和侵襲（圖2B），從而誘發Pca［25］。高通量測序發現，Pca 患者體內SPOP 的相關底物蛋白質存在突變，這類突變使得底物無法與SPOP 結合，逃逸了被泛素化修飾降解的命運，從而誘發Pca（圖2D）。完整梳理SPOP突變如何影響正常SPOP 的結構和功能，以及如何影響底物的功能，是對SPOP突變的Pca 患者實行精準治療的前提。

Pca 中SPOP 基因突變的突變率和突變位點1997 年Nagai 等［26］首次發現SPOP，因其含有1 個POZ 結構域和在核內呈斑點狀散在分布的特征而命名為斑點型POZ 蛋白。隨后的研究闡明了SPOP 作為E3 泛素連接酶銜接蛋白的功能［27-28］。2012 年Barbieri 等［8］首次證實SPOP突變與Pca 發生發展密切相關。

多項全基因組測序或外顯子測序研究發現，SPOP突變在原發性Pca 中占6%～13%，在轉移性Pca 中占14.5%，不同種族和民族背景下的Pca 患者中SPOP的總體突變率為4.6%～14.4%［7］。

Pca 中已發現的SPOP突變均發生在與底物結合的MATH 結構域，這些突變顯著降低了SPOP 與底物結合的親和力，導致SPOP 介導的泛素化功能失活（圖2B 和2C）。通過二代測序（next generation sequencing，NGS）檢測，Pca 中SPOP基因高頻突變位點包括Y87C、Y87N、F102C、S119N、F125V、K129E、W131C、W131G、F133L、F133V 和K134N［8］。其中，F133 發生頻率最高（約50%），其次是Y87、W131、F102、F125、K129、K134 和S119［9］（圖1）。SPOP基因的突變聚集在一個約200 bp 的區域內，為常規DNA 診斷提供了新的檢測靶點。Barbier等［8］發現，在大多數Pca 中只有1 個拷貝的SPOP等位基因發生突變，并且SPOP突變體以顯性負效應抑制野生型SPOP，從而發揮其腫瘤促進功能。同時，底物蛋白必須具備特異的SBC 基序（SPOPbinding consensus motif，SBC motif），即SPOP 結合的共有基序符合Ω-π-S-S/T-S/T（Ω：非極性氨基酸，π：極性氨基酸，S：絲氨酸，T：蘇氨酸）的氨基酸序列［15］。該基序始終存在于SPOP 降解的底物蛋白中，包括磷酸酶Puc［29］、轉錄調節因子Ci/Gli［30］和Daxx［17］和染色質組分MacroH2A［27］等。AR 的SBC基序在部分Pca 患者體內存在突變，無法被SPOP識別，逃避了SPOP 介導的泛素化降解，從而促進Pca 發生［24］（圖2D）。

圖2 SPOP 野生型及突變體與底物結合的示意圖Fig 2 The diagram of the interaction between SPOP-WT/MUT and substrate

SPOP 影響Pca 發生發展的分子機制SPOP蛋白在Pca 細胞中起著關鍵性的抑制作用［31］，Daxx［17］、AR［18］、DDIT3［19］、類固醇受體共激活因子3（steroid receptor coactivator 3，SRC-3）［32］、ETS 相關基因（ETS-related gene，ERG）［33］、DEK［34］、細胞性骨髓細胞瘤病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-MYC）［35］、細胞周期蛋白20（cell division cycle，CDC20）［31］、egl-9 家族缺氧誘導因子2（egl-9 family hypoxia inducible factor 2，EglN2）［36］、溴結構域家族蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）［37］、組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase 6，HDAC6）［38］和程序性死亡受體-配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）［39］等均被證實為SPOP 的底物，并且由于SPOP突變亞型失去結合能力，這些底物不能被泛素化降解，導致蛋白功能紊亂而誘發Pca。突變型SPOP 影響Pca 發生發展產生的機制：介導AR 依賴的信號通路，DNA 損傷修復，腫瘤的免疫反應及線粒體動態調節和內質網應激等（圖3）。

SPOP 與AR 依賴性通路AR 是關鍵的轉錄因子，對于正常前列腺細胞的生長和存活至關重要［18］。SPOP 以AR 依賴性方式促進AR 蛋白的泛素化和蛋白酶體降解，并抑制AR 介導的Pca 細胞的生長［24］。AR 的可變剪接是其中一種重要機制，AR 的鉸鏈結構域中具有SBC 基序645ASSTT649。失去鉸鏈域的AR 剪接體不能被SPOP 識別，逃避了SPOP 介導的泛素化降解，從而促進Pca 發生。目前發現的Pca 相關SPOP突變體主要集中于MATH 結構域，均失去了結合并泛素化降解AR 的能力。雄激素減弱SPOP 結合并降解AR 的能力，而抗雄激素會增強這種能力。一種可能的解釋是，雄激素與AR 結合后改變了其構象，從而影響其SBC 基序與SPOP 結合；而抗雄激素阻斷雄激素與AR 的結合，間接促進SPOP 與AR 結合，有效抑制AR 信號通路［24］。

SRC-3 是SPOP 的靶向底物，也是AR 的激活蛋白。野生型SPOP 能結合并泛素化降解SRC-3，而Pca 來源的SPOP突變體失去結合SRC-3 的能力，SRC-3 持續性激活AR 信號通路而誘發Pca［31-32］。

SRC-3 通過胰島素樣生長因子1（inslin-like growth factor 1，IGF-1）的轉錄上調激活磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳動物雷帕霉素蛋白（phosphoinositide 3-kinase/mammalian target of rapamycin，PI3K/mTOR）信號轉導［40］。在SPOP 突變型Pca 中沒有富集AR 信號通路相關的基因，而是富集PI3K/mTOR 信號轉導相關的基因，因此提出PI3K 和AR信號通路存在顯著的負反饋作用，即PI3K 激活導致AR 信號下調［41-44］。而SPOP突變體在體內外通過SRC-3 激活PI3K/mTOR 信號轉導，并上調AR 相關轉錄因子和共激活因子的網絡，同時維持AR 活動并對抗PI3K 介導的反饋抑制，從而有效激活并協調這兩條對Pca 發生發展至關重要的途徑［45］。

ERG 癌蛋白也是SPOP 的重要底物。SPOP 可調節ERG 蛋白水平，并且SPOP突變會導致ERG的累積，從而促進癌細胞侵襲與增殖［46］。2013 年Chen 等［47］提出ERG 在AR 信號轉導中的“先驅因子”作用，即維持AR 轉錄水平。2015 年再次證明ERG基因融合形成的截短ERG 體不受SPOP 的調控，SPOP突變誘導的癌癥表型很大程度上是通過ERG 介導的。所有TMPRSS2-ERG 融合轉錄本始終受AR 正調控和SPOP 負調控［24，48］。克服截短體ERG 對泛素降解的抵抗，有望成為Pca 的治療新靶點。

SPOP 與DNA 損傷修復基因組不穩定是人類癌癥的基本特征之一。與其他腫瘤亞型相比，Pca 中SPOP突變亞型的基因組重排數量高，這表明SPOP突變亞型腫瘤具有高度的基因組不穩定性［49］。為維持基因組的穩定性，機體進化出高度保守的應答體系——DNA 損傷應答（DNA damage response，DDR）。DDR 包含4 條子途徑：DNA 損傷修復、DNA 損傷檢查點、轉錄反應和凋亡［50］。

SPOP 是Pca 細胞中DDR 的參與者，提示SPOP 對維持基因組穩定性和DDR 完整性具有關鍵作用［49，51］。Boysen 等［49］研究發現，SPOP 可通過調節DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSB，DSB）修復來維持基因組穩定性。SPOP突變改變了DNA 修復過程，削弱了同源重組（homologous recombination，HR），促進易出錯的非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）而導致細胞基因組不穩定，進而誘發Pca［49］。Hjorth-Jensen 等［52］發現SPOP 在抵抗復制壓力過程中起到重要作用。野生型SPOP 與多數參與轉錄、mRNA 剪接和出核的蛋白質有關，例如BRCA2、ATR、CHK1 和RAD51 等。SPOP 促進這些復制因子的轉錄表達，起到減少復制壓力的作用。因此，SPOP 功能的喪失會促進自發復制壓力和基因組不穩定，尤其是SPOP突變或敲低后抑制RAD51 基因的形成，可引起自發復制壓力、損傷修復缺陷和異常的細胞周期［52］。SPOP突變引起修復受損并導致細胞對電離輻射（ionizing radiation，IR）過敏，進一步影響DNA 損傷檢查點，并誘導細胞凋亡。SPOP促細胞凋亡的機制可能是BTB/POZ 結構域影響轉錄調節因子鋅指蛋白的折疊，并調節誘導凋亡的基因轉錄，具體機制有待進一步研究。

AR 信號通路也具有調節DDR 的功能。抑制AR 信號可使PCa 細胞對IR 敏感，并且涉及一些DNA 修復基因的表達，進一步提示SPOP 在維持基因組穩定中的重要作用［18，53］。

SPOP 與免疫近年來腫瘤免疫生物治療已成為治療Pca 的突破點［54］。機體免疫系統不僅免疫監視并清除腫瘤細胞，還能促進腫瘤免疫逃逸。

先天信號轉導者髓系分化初級反應蛋白88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是Toll 樣受體信號通路中的重要轉導蛋白，其依賴的信號通路以及調控的基因產物在固有免疫和適應性免疫中均發揮關鍵作用。Guillamot 等［55］通過蛋白組學研究發現，SPOP 泛素化修飾MyD88，并促進其進入蛋白酶體途徑降解，從而調控緊急造血程序向穩態造血程序的轉換，以限制全身炎癥反應發生。SPOP突變時，MyD88 不能被正常降解，導致IRAK4 激酶過度磷酸化，異常激活MyD88-IRAK4下游的炎癥反應因子NF-κB 和AP-1，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移［55］。Jin 等［56］進一步研究了SPOP 與MyD88 的互作機制，發現在淋巴瘤中SPOP 通過非降解型泛素化修飾MyD88 差異可能由于細胞不一致引起。兩項研究均表明，SPOP 阻斷了MyD88 小體（Myddosome）的組裝和下游NFκB 的激活，證明了SPOP 調控MyD88 對于免疫應答的作用［56］。

研究顯示程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）/PD-1 配體（PD-1 ligand，PD-L1）在許多惡性腫瘤中高表達，PD-1/PD-L1 信號通路的激活可形成免疫抑制性腫瘤微環境，造成腫瘤免疫逃逸，導致腫瘤發生發展［57］。具體機制為：PD-1 及PD-L1在炎癥反應時抑制周圍組織T 細胞的活性，并通過誘導活化的T 細胞凋亡、促進T 細胞衰竭、增強調節性T 細胞的免疫抑制功能、抑制T 細胞的增殖與活化和產生IL-2 等方式調控自身免疫，同時介導腫瘤的免疫逃逸［58］。Zhang 等［39］發現，PD-L1 被SPOP介導的泛素化修飾途徑所降解，在該途徑中SPOP受到細胞周期調節蛋白Cyclin D-激酶CDK4 對其磷酸化的影響。SPOP突變后PD-L1 降解受抑制，導致PD-L1 水平升高以及腫瘤浸潤淋巴細胞數量減少。動物實驗發現，聯合使用CDK4/6 抑制劑和抗PD-1 治療后，腫瘤浸潤淋巴細胞恢復到正常水平，顯著抑制腫瘤進程，并提高小鼠的生存率［39］。聯合使用CDK4 抑制劑和PD-1/PD-L1 阻滯劑具有治療腫瘤的作用。了解SPOP 與免疫相關的信號通路對于臨床免疫治療靶點的研究具有重要意義。

SPOP 與其他通路

SPOP 與線粒體裂變 越來越多的證據表明線粒體的裂變和融合在調節細胞運動、遷移和侵襲中起積極作用［59-60］。線粒體裂變的關鍵參與者反向蛋白INF2 是SPOP 的泛素化底物之一，但SPOP 的泛素化修飾并不會降解INF2，而會減少ER 中INF2定位以及與線粒體相關的DRP1 斑點形成，消除其促進線粒體分裂的能力。Pca 相關的SPOP突變體失去泛素化修飾INF2 的能力，繼而INF2 持續促進線粒體分裂，誘導Pca 細胞遷移和侵襲［25］。

SPOP 與內質網應激 ER 功能被破壞后會產生錯誤折疊和未折疊的蛋白質積聚，未折疊的蛋白反應會減輕這種應激壓力并恢復ER 穩態，從而促進細胞存活和適應，如果不能及時緩解壓力，則會觸發凋亡性細胞死亡［61］。在ER 應激觸發的凋亡中，DDIT3 被強烈誘導，轉移至細胞核，抑制抗細胞凋亡基因的表達，并激活促凋亡基因表達［62］。SPOP識別DDIT3 并對其進行泛素化，促進蛋白酶體途徑降解，而突變體喪失此功能，不能抑制ER 應激誘導的細胞凋亡，進而推動癌癥發展［19］。SPOP突變的腫瘤可能對內質網應激藥物更為敏感，因為這些腫瘤在調節DDIT3 蛋白更新方面存在缺陷。

圖3 SPOP 影響Pca 發生發展的分子機制Fig 3 Schematic of the proposed mechanism through which SPOP suppresses prostate cancer

Pca 組織中SPOP 蛋白表達的臨床意義

PROTAC 技術用于Pca 治療 Pca 發生發展的遺傳因素復雜多樣，有顯著的腫瘤異質性，在基因組序列、表觀遺傳學等分子水平上存在明顯差異［63］。因此，尋找Pca 不同分子分型的差異靶點對腫瘤的精準治療十分重要。針對SPOP突變的分子亞型對于Pca 發生發展的影響，臨床上已研制出多種不同機制的治療藥物。

SPOP突變的患者體內AR 蛋白水平處于較高水平，AR 在Pca 的發展，特別是在去勢抵抗性Pca中起關鍵作用。對于這類患者至關重要的是重新激活E3 泛素降解系統，有效降低AR。目前臨床上使用的AR 抑制劑以恩雜魯胺（enzalutamide）為主，需要維持恩雜魯胺高體內濃度，且該抑制劑在AR蛋白高表達時往往失去活性［64］。由于目前無法通過藥物靶向突變體SPOP 使其恢復野生型活性，考慮到SPOP 在腫瘤組織中的失活突變導致促癌蛋白AR 的積累，降低這些促癌蛋白的蛋白水平應當可以抑制SPOP突變型Pca 的惡性增殖。蛋白質降解靶 向 聯 合 體（proteolysis targeting chimeras，PROTAC）技術是靶向降解特異蛋白質的一種新方法，PROTAC 是一種雙功能雜合分子，可同時結合E3 泛素連接酶和靶蛋白，從而驅動靶蛋白被泛素結合進入蛋白酶體途徑而降解［65］（圖4）。考慮到SPOP突變患者體內的AR 無法被降解，Jemilat等［66］設計了特異靶向AR 的PROTAC——ARCC-4，其降解AR 蛋白的效率比恩雜魯胺強約10 倍。ARCC-4 以低濃度有效降解與抗雄激素治療相關的AR 突變體，并在AR 蛋白高水平中保持其降解AR和抑制細胞增殖的能力，但ARCC-4 的細胞通透性及其差向異構體的效價遠低于恩雜魯胺［66］。經過改進，ARV-110 在保證低濃度高效靶向降解AR 的基礎上解決了細胞通透性差的問題，并獲得臨床藥物試驗許可。2020 年5 月的臨床實驗結果顯示，ARV-110 在患者體內能成功降解AR［67］。

圖4 利用PTOTAC 技術降解AR 蛋白的模式圖Fig 4 The diagram of degradation of AR using PROTAC technique

含溴結構域和ET 域（bromodomain and extraterminal，BET）蛋白也是Pca 的治療靶點，BET 抑制劑（如JQ1 和I-BET）已廣泛用于臨床治療，一方面降低表觀遺傳調節劑BET 蛋白以抑制細胞分裂［68-70］，另一方面通過阻斷BRD4 而抑制AR 介導的轉錄。Zhang 等［37］發現野生型SPOP 能夠結合BRD4，促進其進入蛋白酶體途徑降解。然而，在部分SPOP突變的Pca 患者中BRD4 無法被正常降解，進一步導致SPOP突變的PCa 亞型中AKTmTORC1 信號的激活和對BET 抑制劑的抗性［45，71-72］，對該類抑制劑產生耐受性。因此，BET 抑制劑僅適用于不存在SPOP突變或存在SPOP突變但不產生耐藥性的患者，這為Pca 的精準治療提供了新思路。考慮到SPOP突變的Pca 患者體內缺乏正常活性的E3，靶向BET 的PROTAC 降解劑ARV-771 對于臨床上具有BET 抑制劑抗性的Pca患者具有治療潛力［73］。

免疫治療 免疫療法已成為廣泛研究的癌癥治療方法。免疫檢查點抑制劑阻斷腫瘤細胞和/或免疫細胞的凋亡信號蛋白，以防止腫瘤細胞誘導免疫細胞死亡。Zhang 等［39］研究表明，CDK4/6 抑制劑聯合PD-1/PD-L1 阻滯劑具有抑制腫瘤免疫侵襲的作用。CDK4/6 抑制劑能通過抑制SPOP 磷酸化使其被E3 連接酶APC/C 的共激活因子Cdh1 降解，從而在PD-L1 蛋白水平升高的基礎上使用PD-1/PDL1 阻滯劑達到治療目的。

結語SPOP 介導Pca 發生發展的機制有待進一步探索，新的分子靶點有望成為Pca 新的生物學分型標志物，并為Pca 患者個體化治療、基因治療藥物研制以及臨床用藥等提供新的思路。