基于網絡藥理學研究丹紅化瘀湯治療視網膜病變的潛在作用機制

吳 堅，張錫洪，徐文堅

（1.廣東省汕頭市中心醫院·中山大學附屬汕頭醫院，廣東 汕頭515000；2.廣東省中山市小欖人民醫院，廣東 中山528400）

丹紅化瘀口服液由陳達夫教授血府逐瘀湯加減化裁并通過特殊工藝研制而成，方中丹參（DS）、當歸（DG）活血祛瘀、養血潤燥，消目中之瘀血，為君藥；川芎（CX）、桃仁（HR）、紅花（HH）活血散瘀、疏肝行氣，為臣藥，助君藥行消目中瘀血積滯之效；柴胡（CH）、枳殼（ZQ）疏肝理氣開郁，使氣機條暢、氣血調和，為佐藥。諸藥合用，共奏活血化瘀、行氣通絡之功效，適用于氣滯血瘀引起的視物模糊等癥。常見視網膜病變包括糖尿病性視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、黃斑病變、新生兒視網膜病變等，以視力變化、眼底出血、滲出、水腫、增殖等為常見臨床表現，屬中醫“視瞻昏渺”“云霧移睛”“暴盲”等范疇，臨床辨證包括氣滯血瘀、絡脈瘀阻、肝腎虧虛等。丹紅化瘀口服液對糖尿病性視網膜病變（DR）、視網膜靜脈阻塞（RVO）等視網膜病變有較好療效，尤其對視網膜血管病變引起的多種疾病有良好療效，臨床應用前景廣闊。研究表明，丹紅化瘀口服液對DR有效率達82.75%，可明顯降低血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）水平，同時改善血液流變學指標，減輕眼底出血情況，改善眼底的循環障礙，減少微血管瘤形成，促進視力恢復，減緩DR病情進展[1-4]。另有試驗表明，丹紅化瘀口服液可下調RVO患者房水中VEGF和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，下調血清VEGF、TNF-α、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）和炎性因子細胞間黏附分子-1（ICAM-1）水平，抑制新生血管形成，促進眼底出血吸收和消退，減輕炎性損傷，改善視力[5-7]。網絡藥理學是在系統生物學與計算機技術高速發展的基礎上發展起來的，基于疾病基因-靶點-藥物交互作用網絡的基礎上，通過網絡分析，系統綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預與影響[8]。本研究中基于丹紅化瘀湯多成分、多靶點作用的特點，遵循網絡藥理學理論與技術，通過篩選丹紅化瘀湯藥物活性成分、預測丹紅化瘀湯治療視網膜病變的靶點及靶點的生物功能和通路分析，構建化合物-靶點-通路網絡，預測和闡述丹紅化瘀湯治療視網膜病變的分子作用機制，為藥物的試驗研究及臨床應用提供科學依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 丹紅化瘀湯的活性成分及靶點收集與篩選

在中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/index.php）上設定參數口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18[9]，篩選丹紅化瘀湯組方中7味中藥在人體內生物活性較高的化合物成分 及 其 靶 點，通 過Pubchem數 據 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）驗證獲取化合物分子機構，通過String數據庫（https：//string-db.org）搜索TCMSP平臺所獲取靶點蛋白，設定物種為人（homosapiens），獲得靶點采用官方名稱。

1.2 視網膜病變相關靶點的收集及篩選

在OMIM數據庫（https：//omim.org/）、TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）和GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）檢 索“RetinalDiseases”獲取視網膜病變相關靶點，并通過String數據庫，設定物種為人（homosapiens），獲得靶點采用官方名稱。

1.3 丹紅化瘀湯治療視網膜病變靶點的預測及網絡構建

通過比對丹紅化瘀湯化合物靶點及視網膜病變相關靶點，預測丹紅化瘀湯治療視網膜病變的靶點，將藥物、化合物、治療靶點、疾病信息導入Cytoseape_v3.7.2軟件（http：//www.cytoscape.org/），構建藥物-化合物-靶點-疾病網絡并進行拓撲分析，根據介度（BC）、緊密度（CC）的中位數及連接度（Degree）中位數的2倍值卡值篩選丹紅化瘀湯治療視網膜病變的關鍵藥效分子。將預測靶點信息導入String數據庫，設定物種為人（homosapiens），選擇高置信度，獲得丹紅化瘀湯治療視網膜病變靶點的交互作用關系信息，在Cytoseape中構建靶點間的交互作用網絡，并進行拓撲分析，根據BC和CC的中位數及Degree中位數的2倍值來卡值篩選核心靶點，并構建核心靶點交互作用網絡。

1.4 丹紅化瘀湯治療視網膜病變關鍵靶點的驗證

以陽性藥物羥苯磺酸鈣作為對照，使用分子對接模擬軟件Autodock_vina對Degree值前10的核心靶點與Degree值前10的關鍵藥效分子進行分子對接驗證。

1.5 生物功能與通路富集分析及藥物-化合物-靶點-通路網絡構建

將丹紅化瘀湯治療視網膜病變靶點導入David6.8數 據 庫（https：//david.ncifcrf.gov/），設 定 物 種 為 人（homosapiens），進行GO生物學富集分析及KEGG通路富集分析，收集P＜0.05的結果。在Cytoseape中構建藥物-化合物-靶點-通路網絡。

2 結果

2.1 丹紅化瘀湯的活性成分及靶點

在TCMSP平臺上根據口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18[8]，剔除重復化合物及缺少靶點預測的化合物，通過Pubchem驗證分子結構，共收集到丹紅化瘀湯組方中7味中藥的109種活性成分，其中丹參含有49種，當歸含有2種，紅花含有17種，桃仁含有18種，柴胡含有13種，川芎含有6種，枳殼含有5種。OB和DL排名前30的活性成分信息見表1。根據活性成分TCMSP平臺收集靶點信息，經String數據庫校正后，共獲得260個靶點。

2.2 藥物-化合物-靶點-疾病網絡構建及關鍵藥效分子分析

從OMIM數據庫、TTD數據庫、GeneCards數據庫收集篩選到8 030個視網膜病變相關靶點，在與丹紅化瘀湯靶點比對后，結果丹紅化瘀湯的106種活性成分的227個靶點可作為治療視網膜病變的潛在靶點。在Cytoseape中構建丹紅化瘀湯治療視網膜病變的藥物-化合物-靶點-疾病網絡并進行拓撲分析，結果BC中位數為0.000 544 245，CC中位數為0.365 342 16，Degree中位數2倍值為10，根據該結果篩選出關鍵藥效分子32個，如槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、木犀草素（MOL000006）、柚皮素（MOL004328）等，度值越高，活性成分相關治療靶點越多，關鍵藥效分子可能在丹紅化瘀湯治療視網膜病變的過程中起到了重要作用，其信息及度值見表2。藥物-化合物-靶點-疾病網絡見圖1，其中深綠色節點為關鍵藥效分子。

表1 OB和DL排名前30的丹紅化瘀湯活性成分信息

2.3 靶點交互作用網絡構建及核心靶點分析

基于String數據庫分析227個靶點間的交互作用，獲取高置信度結果，在Cytoseape中構建丹紅化瘀湯治療視網膜病變靶點的交互作用網絡并進行拓撲分析，結果BC中位數為0.001 6，CC中位數為0.42，Degree中位數2倍值為28，以上述數值卡值篩選獲得41個核心靶點，其信息與拓撲參數見表3。經String數據庫分析后，在Cytoseape中構建丹紅化瘀湯治療視網膜病變的核心靶點高置信度交互作用網絡圖，詳見圖2，網絡圖共有41個節點，507條邊，節點Degree值越高，顏色越深，直徑越大。

表2丹紅化瘀湯治療視網膜病變的關鍵藥效分子信息

2.4 分子對接模擬驗證結果

應用分子對接模擬軟件Autodock_vina對Degree值前10的活性成分與靶點進行分子對接驗證，10個靶點蛋白信息見表3，槲皮素（MOL000098）與MAPK3的分子對接模擬可視化圖見圖3。可見，槲皮素與周圍分子之間存在氫鍵、芳環堆積作用、范德華力等不同分子間交互作用，與受體分子能較好地結合。應用Autodock_vina計算藥效分子與受體間的最低結合能并作熱圖，詳見圖4。可見，所有藥效分子與靶點蛋白受體的最低結合能都小于0，兩者可自發結合，靶點蛋白AKT1，TP53，MAPK8，MAPK1，JUN，VEGFA，EGF，MAPK3，STAT3與10個關鍵藥效分子最低結合能均小于-5.0 kJ/mol，提示上述靶點蛋白與藥效分子結合較好[10]，且陽性對照藥物羥苯磺酸鈣與靶點蛋白分子對接的最低結合能均在-5.0 kJ/mol，驗證了靶點蛋白晶體及配體選擇的合理性。

圖1丹紅化瘀湯治療視網膜病變的藥材-成分-靶點-疾病網絡圖

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

應用David數據庫對221個丹紅化瘀湯治療視網膜病變的靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析，取P＜0.05的結果，共收集到761個GO條目，572個生物過程條目，67個細胞組分條目，122個分子功能條目。篩選與視網膜病變有關的P值最小的前20個GO條目作圖，詳見圖5。其中，炎性反應、細胞老化、血管生成、血管生成的正調控、平滑肌細胞增殖的正調控等富集程度高，且與視網膜病變關系密切。KEGG通路分析共富集到58條與視網膜病變的通路，取P值最小的前20個作圖，詳見圖6，其中TNF信號通路、低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶（PI3K-AKT）信號通路、VEGF信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等富集度高且與視網膜病變關系密切。

2.6 藥物-化合物-靶點-通路網絡構建

在Cytoscape中構建藥材-成分-靶點-通路網絡，詳見圖7，其中同類顏色深者為關鍵藥效分子或核心靶點。網絡圖中共有343個點和1 404條邊，丹紅化瘀湯組方中的7味中藥、206種化合物、227個靶點與20條不同的通路相關，共同調節機體的生理基礎與代謝功能，提示丹紅化瘀湯對視網膜病變的治療作用機制有著多成分、多靶點、多通路的特點。

3 討論

丹紅化瘀湯有活血化瘀、行氣通絡的功效，對DR和RVO等視網膜病變有良好療效。本研究中基于多成分、多靶點作用的研究思路，應用網絡藥理學技術對丹紅化瘀湯治療視網膜病變的靶點進行分析，構建藥物-化合物-靶點-通路網絡，闡述丹紅化瘀湯治療視網膜病變的分子作用機制，為丹紅化瘀湯的試驗研究和臨床應用提供依據。

表3丹紅化瘀湯治療視網膜病變的核心靶點及其拓撲參數

圖2丹紅化瘀湯治療視網膜病變的核心靶點高置信度交互作用網絡

圖3槲皮素（MOL000098）與MAPK3的分子對接模擬可視化圖

在篩選出的關鍵藥效分子中，多為黃酮類化合物及其衍生物，如槲皮素、柚皮苷、黃芩苷、丹參酮、毛地黃黃酮等。黃酮類化合物在中草藥及天然產物中分布廣泛，并有抗炎、抗菌和抗氧化活性[11]。研究表明，黃酮類化合物對氧化誘導的在體和離體視網膜色素上皮細胞均有保護作用[12]；柚皮苷能減輕糖尿病性視網膜病變試驗模型中的炎性反應、氧化應激和核因子κB（NF-κB）活化[13]；槲皮素可通過抑制自噬而對高糖誘導的脈絡膜和視網膜血管生成發揮抑制作用[14]，從而延緩DR進程；黃芩苷有明顯抑制視網膜細胞外炎性水腫的作用[15]；丹參酮ⅡA會明顯抑制高糖環境下人視網膜血管內皮細胞的增殖、遷移、血管成形方面的體外生物學作用，對于防治DR的發生，延緩其病理進程，可起到一定作用[16]。此外，天然類黃酮化合物可影響眼球血流量，其中毛地黃黃酮等含有多個羥基基團的黃酮分子，可顯著提高眼球血流量和促進視網膜功能的恢復。可見，以黃酮類化合物為主的關鍵藥效分子在丹紅化瘀湯治療視網膜病變的生物學過程中發揮著重要作用。

圖4 Degree值前10的關鍵藥效分子與核心靶點分子對接最低結合能熱圖

表4 Degree值前10靶點的受體蛋白信息

基于丹紅化瘀湯治療視網膜病變靶點的交互作用，網絡分析共收集到41個核心靶點，結合分子對接驗證結 果 分 析 發 現，AKT1，TP53，MAPK8，MAPK1，JUN，VEGFA，STAT3，EGF，MAPK3可能是丹紅化瘀湯治療視網膜病變的關鍵靶點，分別從炎性反應、氧化應激、新血管生成、細胞增生與凋亡等生物過程發揮治療作用。這9個靶點與所選的10個關鍵藥效分子最低結合能均小于-5.0 kJ/mol，表明上述靶點與活性成分有結合活性，從分子與靶點的作用角度驗證了核心靶點篩選結果的合理性。

圖5 GO生物富集分析氣泡圖

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7丹紅化瘀湯治療視網膜病變的藥材-成分-靶點-通路網絡

VEGF是一種高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素，能刺激血管內皮細胞的有絲分裂與遷移，增加血管的通透性，誘導毛細血管腔的形成，在新生血管性視網膜病變中可發揮重要作用。視網膜靜脈阻塞、增生型糖尿病視網膜病變和早產兒視網膜病變等疾病有類似的發病機制[17]，即在視網膜缺氧、缺血環境下，多種細胞分泌VEGF，其高表達可導致視網膜新生血管形成[18]。此外，VEGF還可通過影響其他細胞因子和通路活性導致視網膜新生血管生成；上調視網膜血管的ICAM-1表達水平，增強血小板聚集功能，促進白細胞黏附，使視網膜缺血缺氧情況持續加重，加速新生血管形成[19]。低氧和高糖環境下，VEGF過度表達，通過受體KDR和FIT-1，能誘導下游PI3K-AKT信號通路的激活，可加速內皮細胞發生遷移、增殖，形成新生微血管腔[20]，加速病情發展。丹紅化瘀湯中丹參的活性成分丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、異丹參酮等能調節VEGF表達，抑制血管新生成，能起到減緩DR病情進展的作用。丹參、紅花、柴胡中的黃芩苷能通過抑制氧化應激，增強缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）降解，降低VEGF分泌，表現出抗血管生成作用[21]。研究表明，丹參化瘀湯能調節VEGF表達，降低血管通透性，減少新生血管生成，改善血液流變學指標，預防纖維增生，延緩病情發展[5-7]。

蛋白激酶B（AKT）屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，控制增殖、凋亡、代謝、轉導等重要的細胞功能，其與新生血管的形成密切相關[22]，被視為病理性血管形成治療的有效方法[23]。研究表明，缺氧環境下對氧誘導的視網膜病變模型小鼠玻璃體腔內注射AKT抑制劑后，能明顯減少視網膜新生血管的形成[24]，提示AKT活性會影響新生血管性視網膜病變的產生與發展。AKT是PI3K下游的直接作用靶點，PI3K-AKT通路在KEGG通路分析中富集基因較多，且與VEGF信號通路、mTOR信號通路等通路密切相關。增生性玻璃體視網膜病變（PVR）的增殖期中，激活PI3K-AKT信號通路及其下游的mTOR信號通路會使眼內細胞增殖與凋亡平衡失調，導致PVR的形成[25]。槲皮素可直接與PI3K的ATP結合位點結合抑制其活性，并能競爭性抑制AKT活性[26]，通過抑制AKT和MAPKs家族，使NF-κB信號失活，從而抑制VEGF誘導的視網膜光感受器細胞過度炎性反應[27]。可見，丹紅化瘀湯可能通過抑制AKT的磷酸化與PI3K-AKT通路的激活，調控細胞增殖與凋亡及新生血管的生成，達到治療視網膜病變的效果。

表皮生長因子（EGF）是促視網膜色素上皮細胞（RPE）增生最強的生長因子，EGF及其受體EGFR能誘導RPE細胞增生、移行，并可引起其形態改變[28]，進而促進PVR的發生、發展。EGF與EGFR結合后能激活MAPK信號通路和PI3K/AKT信號通路，調節EGF、VEGF等細胞因子的表達，并共同參與RPE細胞的增生與遷移[29]。研究表明，槲皮素對由EGF刺激引起的RPE細胞增生抑制作用很強[26]，丹紅化瘀湯可通過抑制EGF引起的RPE細胞增生達到緩解PVR病情的效果。

綜上所述，本研究中應用網絡藥理學方法對丹紅化瘀湯治療視網膜病變的分子作用機制進行了研究，分析了丹紅化瘀湯治療視網膜病變的關鍵藥效分子核心靶點，并應用分子對接模擬技術對核心靶點進行了驗證，構建了丹紅化瘀湯治療視網膜病變的靶點交互作用網絡和藥物-化合物-靶點-通路網絡，主要闡述了丹紅化瘀湯通過多靶點、多通路作用從抗炎、抗氧化、調節細胞增生、細胞凋亡及新血管生成等方面發揮治療視網膜病變的潛在機制，為丹紅化瘀湯治療視網膜病變的臨床應用及作用機制的研究提供了參考依據。