對羥基苯甲醛的代謝物在大鼠體內的藥代動力學研究*

馮 晉，楊建光，楊瓊英，徐婭玲，何芳雁

（云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明650000）

對羥基苯甲醛（4-HBd）是天麻腦保護作用的指征性成分之一，具有對抗腦缺血再灌注損傷（CIRI）[1]、保護血腦屏障（BBB）[2]、抗血小板聚集[3]、抑制鈣超載[4]、減輕神經炎癥損傷[5-6]等作用。采用微透析取樣技術結合高效液相色譜（HPLC）法，對4-HBd進行藥代動力學（簡稱藥動學）研究，發現4-HBd可在外周迅速代謝為對羥基苯甲酸（4-HBA），并可在腦中檢測到4-HBA，且僅有少量原型藥進入腦內。由于病理學狀態可影響藥物在體內的藥動學特征，為了考察4-HBA在正常大鼠和大腦中動脈阻塞/再灌注損傷（MCAO/R）模型大鼠體內的藥動學差異，本研究中在前期基礎上對大鼠灌胃4-HBd后其代謝物4-HBA的血漿藥動學進行研究，比較4-HBA在正常及MCAO/R模型大鼠體內的變化，分析CIRI的病理狀態對4-HBd代謝物4-HBA在大鼠體內藥動學的影響，以期在分析4-HBA體內過程的同時為原形藥發揮藥效作用的作用機制提供參考?，F報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Culex型微透析儀（美國BASi公司）；PF5001型激光多普勒血流監測儀（瑞典Perimed公司）；CF16RXⅡ型低溫離心機（日本Hitachi公司）；XW-80A型渦旋混勻振蕩器（江蘇海門市麒麟醫用儀器廠）；NDK200-1型氮吹儀（杭州米歐儀器有限公司）；Dionex U3000型超高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 試藥

對羥基苯甲醛（美國百靈威科技有限公司，純度為99.89%，批號為L470Q62）；乙 腈（色 譜純，批號 為158927），甲醇（色譜純，批號為154447），均購自賽默飛世爾科技有限公司；冰乙酸（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司，批號為150811）；乙酸乙酯（分析純，四川西隴化工股份有限公司，批號為160105）；異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，批號為217170702）。

1.3 動物

200～240 g SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK＜湘＞2016-0002，合格證號為43004700038286）12只。試驗動物進入實驗室后進行適應性飼養，每日定時供食及飲水，定期更換墊料，保持動物生活環境干凈整潔。飼養環境溫度18～24℃，相對濕度為40%～60%。

2 方法與結果

2.1 大鼠MCAO/R模型的復制與評價

2.1.1 大鼠MCAO/R模型的復制

取體質量為200～240 g的雄性SD大鼠，取頸部正中偏右0.5 cm處切口，約1.5 cm，分離大鼠右側頸總動脈和迷走神經。結扎頸總動脈近心端，遠心端用動脈夾夾閉，在距分叉1 cm處剪一“V”形缺口，將栓線經缺口插入。松開動脈夾，調整栓線進入大腦，栓線插入深度為18～20 mm。采用激光多普勒血流監測儀檢測腦血流量變化，血流量下降至基礎值的20%～30%時停止插栓，完成一側大腦中動脈阻塞（MCAO）。MCAO后2 h再灌注時輕拉線栓，使其頭端回到頸總動脈內，即可實現大腦中動脈再灌注，再灌注2 h后給予受試物并取樣[7-9]。

2.1.2 大鼠MCAO/R模型的評價

Longa5法神經學評分：0分為無神經功能缺損癥狀；1分為輕度局灶性神經功能缺損，即提尾懸空不能伸展左側前爪；2分為中度局灶性神經功能缺損，即行走向左側轉圈；3分為中度局灶性神經功能缺損，即行走困難，并向左側傾倒；4分為不能自發行走，意識水平下降。1～3分為成功[7]。

激光多普勒監測儀檢測腦血流量評價：造模后，當腦血流量降至基礎值的20%，且在再灌注2 h后腦血流量有所回升，視為模型成功[10]。

MCAO/R模型成功標準：以上2種評價方法均成功為模型成功，所得實驗數據納入結果統計。

MCAO/R模型評價結果：結果顯示，模型大鼠有明顯的神經功能缺失癥狀，神經病學平均評分為（2.33±0.82）分；MCAO/R大鼠經激光多普勒檢測腦血流量，MCAO前 為（100±0.00）%，MCAO后 為（12.65±3.92）%，再灌注后為（54.12±7.24）%，造模后大腦中動脈平均腦血流量已降至基礎值的12.65%，且在再灌注2 h時腦血流量有所回升。

2.2 微透析采血

2.2.1 微透析采血方法建立

大鼠麻醉后，頸正中往左上側開約1 cm創口，分離頸靜脈，剪一“V”形口，插入采血引導管，將引導管沿近心端方向插入頸靜脈，并將引導管從大鼠頸后部開口引出，連接微透析采血系統，按設置時間自動采集血樣。

2.2.2 微透析取樣

將大鼠放置在微透析儀的活動裝置內，將微透析儀采血系統管路與頸靜脈插管大鼠相連，設置取樣程序為1，3，6，10，15，20，30，45，60，75，90，120 min，采血量250μL。儀器準備完成后灌胃，其中MCAO/R模型大鼠在缺血2 h再灌注2 h后灌胃，灌胃后，啟動微透析采血系統，取樣。

2.3 動物分組與給藥

將大鼠分為正常組、MCAO/R模型組，每組6只。實驗前禁食12 h，自由飲水。正常組和MCAO/R模型組給藥劑量按400 mg/kg、給藥體積按1 mL/100 g灌胃給予4-HBd。

2.4 代謝物4-HBA體內分析方法學考察

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸水溶液（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：25℃；進樣量：40μL。

2.4.2 樣品前處理

取全血樣品，以13 000 r/min的轉速于4℃離心10 min，取上層血漿100μL，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩萃取2 min，4 000 r/min離心10 min，取乙酸乙酯層，殘留物加入1 mL乙酸乙酯重復上述操作，合并2次乙酸乙酯層，氮氣吹干，100μL流動相渦旋振蕩2 min復溶，13 000 r/min離心10 min，取上清液40μL，進樣。

2.4.3 方法學考察

專屬性考察：分別考察空白血漿樣品、含代謝物對照品血漿、給藥后血漿樣品，處理后，采用高效液相色譜（HPLC）法進行測定，結果4-HBA的保留時間為7.8 min，4-HBA出峰良好，且無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：取9.98 mg 4-HBA，精密稱定，置10 mL容量瓶內，加流動相定容，作為母液，稀釋成質量濃度為998，499，249.50，124.75，62.38，31.19，15.59，7.80，3.90，1.95，0.97，0.49，0.24 mg/L的系列血漿樣品。處理后，依法測定，作回歸曲線，得4-HBA回歸方程Y=0.010 09X-37.550 40（R2=0.999 56），線性范圍為0.24～998 mg/L，定量下限為0.24 mg/L（S/N＞9）。

圖1高效液相色譜圖

精密度和準確度考察：制備高、中、低3個（質量濃度499.00，15.59，0.49 mg/L）的4-HBA血漿質控樣品。處理后，采用HPLC法進行測定，1 d內平行操作5次，連續測定3 d。結果該方法的準確度在85%～115%范圍內，精密度的RSD小于15%，符合要求。詳見表1。

表1含4-HBA血漿的精密度和準確度試驗結果（n=5）

穩定性試驗：制備高、中、低3個質量濃度（499.00，15.59，0.49 mg/L）的4-HBA血漿質控樣品。處理后，分別在室溫下放置4 h、-20℃下放置7 d、反復凍融3次，采用HPLC法平行測定5次。結果準確度相對誤差和RSD均小于15%，表明血漿中的4-HBA在以上3種條件下均能保持穩定。詳見表2。

提取回收率和基質效應測定：1）提取回收率。制備高、中、低3個質量濃度（499.00，15.59，0.49 mg/L）的血漿質控樣品。處理后，HPLC法測定所得峰面積記為A1。另取大鼠空白血漿同法處理，取上清液加入已吹干的4-HBA質控濃度溶液中，HPLC法測定所得峰面積記為A2。計算提取回收率（A1/A2）。2）基質效應。取雙蒸水代替空白血漿，其余步驟同提取回收率項下A2的處理方法，采用HPLC法測定所得峰面積記為A3。以3種質量濃度2種處理方法下所得峰面積比值（A2/A3）計算基質效應。結果血漿中提取回收率與基質效應均在85%～115%范圍內，RSD小于15%，符合要求，無明顯基質效應。詳見表3。

表3含4-HBA血漿的提取回收率和基質效應（%）

2.5 灌胃4-HBd后代謝物4-HBA在大鼠體內的藥動學特征

血藥濃度-時間曲線：灌胃400 mg/kg 4-HBd后代謝物4-HBA在大鼠體內的血藥濃度-時間曲線見圖2。藥動學參數：大鼠灌胃400 mg/kg 4-HBd后代謝物4-HBA在大鼠體內的藥動學參數見表4。

圖2大鼠灌胃400 mg/kg 4-HBd后代謝物4-HBA的血藥濃度-時間均數曲線（n=6）

2.6 統計學處理

采用DAS 3.0軟件進行繪圖并統計，藥動學參數均以非房室模型統計矩計算。

3 討論

藥物代謝是藥動學研究中最復雜的部分，是藥物在體內消除的重要途徑，是藥物在體內產生或失去藥效與毒性的重要過程，藥物進入生物體后在藥酶作用下與機體間發生一系列的相互作用，藥物結構發生了改變[11]。多數藥物經代謝失去藥理活性后隨尿液或膽汁排出體外，但也有一些藥物經代謝后藥理活性增強或產生了毒性代謝產物，藥物代謝對藥物作用的強弱、作用持續時間、藥物治療的安全性等方面均有不同程度的影響[11-12]。采用微透析技術對活體動物進行取樣，具有實時、高效、在線的優勢，對動物的損傷小，可在動物保持清醒的狀態下連續取樣，動態地監測內源性或外源性物質的濃度，獲取真實、可靠的數據[13-14]。

表2含4-HBA血漿的穩定性試驗結果（n=5）

表4 4-HBA在大鼠體內的藥動學參數（n=6）

前期研究結果顯示，4-HBd在正常大鼠體內AUC0-∞為（59.14±16.48）mg·min/L，在MCAO/R模型大鼠體內AUC0-∞下降至（17.37±5.78）mg·min/L，提示CIRI的病理狀態影響4-HBd的藥動學過程，4-HBd吸收進入血液循環的量減少到正常大鼠的30%，推測4-HBd形成了代謝產物進入血液循環。經鑒定，4-HBd的代謝產物為4-HBA。為考察4-HBd的代謝產物4-HBA的藥動學特征，本研究中建立了4-HBA的HPLC分析方法，經驗證，該方法的方法學考察結果均符合國家食品藥品監督管理局對生物樣品分析方法學考察的要求，可用于代謝物4-HBA在大鼠體內的藥動學研究。同時，為了解CIRI的病理狀態對4-HBA藥動學過程的影響，本研究中采用線栓法復制大鼠MCAO/R模型模擬CIRI病理損傷，灌胃給予4-HBd后，對其代謝產物4-HBA的藥動學特征進行了考察。結果顯示，4-HBA在正常和MCAO/R模型大鼠體內分別在10.667 min和8.833 min達峰，半衰期分別為31.805 min和78.847 min。由于一分子的4-HBA是由一分子的4-HBd反應得來，且二者相對分子質量接近。因此，按代謝物與原形藥物AUC的比值計算代謝率，在正常和MCAO/R模型病理狀態下的代謝率分別約為3.44×104%和5.71×104%。結果表明，灌胃4-HBd后，在大鼠血漿中的代謝物4-HBA的暴露量要明顯大于4-HBd，且MCAO/R模型組的代謝率大于正常組，MCAO/R模型的病理狀態會使4-HBA的代謝率增加，半衰期延長。由前期研究結果可知，4-HBd具有良好的腦保護作用，4-HBA無腦保護作用，4-HBd的絕對生物利用度低。認為4-HBd轉化為代謝物這一過程可能在4-HBd產生腦保護作用中起到了重要作用。

為了明確產生代謝物的過程與腦保護作用指征性成分4-HBd與發揮腦保護作用的相關性，課題組后續將在前期研究基礎上，進行4-HBd的代謝機制及4-HBA在大鼠體內的分布特征研究，明確其代謝部位和分布規律，并探討其是否在特定部位發生代謝從而發揮腦保護作用，以期從藥動學角度揭示4-HBd腦保護的作用機制。