不同促滲劑對(duì)右旋酮洛芬氨丁三醇水凝膠貼劑透皮吸收的影響

陳永順，楊金霞，王啟斌

（湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰442000）

右旋酮洛芬氨丁三醇（DKT）是具有苯丙酸結(jié)構(gòu)的非甾體抗炎藥，具有抗炎、抗風(fēng)濕和鎮(zhèn)痛藥理活性[1-2]。但其半衰期較短，有效血藥濃度維持時(shí)間有限，對(duì)胃腸道刺激性較大。水凝膠貼劑具有無刺激性、載藥量大、透皮效果好、生物利用度高及透氣性好等優(yōu)點(diǎn)[3]。將DKT制成水凝膠貼劑，可發(fā)揮長效鎮(zhèn)痛作用，減少胃腸道不良反應(yīng)。皮膚的屏障作用限制了大多數(shù)藥物的有效吸收，故在貼劑的處方中會(huì)添加合適的促滲劑，以促進(jìn)藥物的透皮吸收。目前，常用促滲劑有尿素、油酸、氮酮、薄荷醇、丙二醇及N-甲基吡咯烷酮等。在前期試驗(yàn)[4]的基礎(chǔ)上，本研究中采用體外透皮吸收法，考察一元促滲劑及多元促滲劑對(duì)DKT水凝膠貼劑的促滲作用，以優(yōu)選促滲劑；同時(shí)研究了DKT水凝膠貼劑（無促滲劑組和含促滲劑組）在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，考察其體內(nèi)促滲效果。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

Waters 600型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；改良Franz擴(kuò)散池（自制）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司，精度為0.000 1 g）；TGL-16BG型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SK-1型快速混勻器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；氮?dú)獯蹈蓛x（上海鄆曹電子科技有限公司）。

1.2 試藥

右旋酮洛芬氨丁三醇（武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，批號(hào)為20190215）；右旋酮洛芬氨丁三醇對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為180316-20150，純度為99.36%）；萘普生鈉對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100330-200702）；聚丙烯酸Viscomate NP800（山東精細(xì)化工有限公司，批號(hào)為20180926）；氮酮（浙江利康化工有限公司，批號(hào)為20190621）；EDTA（天津市百世化工有限公司，批號(hào)為20080609）；聚維酮K-90（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為7600162502）；尿素（青島海洋化工廠，批號(hào)為20081126）；甘羥鋁（批號(hào)為20190618）、丙二醇（批號(hào)為20190118）均購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；油酸（批號(hào)為20190230）、N-甲基吡咯烷酮（批號(hào)為20190619），均購自天津市博迪化工有限公司；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量為（200±20）g，動(dòng)物合格證號(hào)為SCYY（鄂）2019-0011；比格犬，6只，雌雄各半，體質(zhì)量為（15±0.2）kg，動(dòng)物合格證號(hào)為SCYY（鄂）2019-0028。所有動(dòng)物均由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，試驗(yàn)的操作規(guī)程和協(xié)議都按照湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)頒布的試驗(yàn)動(dòng)物使用和保護(hù)指導(dǎo)守則進(jìn)行。Wistar大鼠和比格犬每天供給統(tǒng)一的飼料和水，飼養(yǎng)溫度為室溫（20～24℃）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件[5]

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×6.0 mm，5μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液（68 g磷酸二氫鉀溶于1 000 mL水中，磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5）-乙腈-水（2∶43∶55，V/V/V）；測定波長：257.00 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：35℃。

2.1.2 溶液制備與測定

取DKT對(duì)照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為800 mg/L的對(duì)照品溶液，備用。取DKT對(duì)照品溶液、空白貼劑（陰性對(duì)照品溶液）和DKT貼劑的透皮吸收試驗(yàn)的接收液（供試品溶液），經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。DKT的保留時(shí)間為9.26 min，色譜圖見圖1。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：將對(duì)照品溶液用流動(dòng)相稀釋為質(zhì)量濃度分別為2，10，20，100，200，400，800 mg/L的系列溶液。分別取20μL，注入色譜儀，按擬訂色譜條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=9 258X-165（r=0.999 8）。結(jié)果表明，DKT質(zhì)量濃度在2～800 mg/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為100 mg/L的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣20μL，連續(xù)測定3 d。結(jié)果DKT的日內(nèi)RSD和日間RSD分別為0.21%和0.48%（n=6），表明儀器精密度良好。

（2）教師要深入把控教學(xué)生成問題。“植物的生殖”一課中，教師采用了生物學(xué)中常用的對(duì)比學(xué)習(xí)法，對(duì)有性生殖和無性生殖兩種生殖方式在形成過程、遺傳特性、與母體的性狀一致性和后代個(gè)體變異等多個(gè)方面進(jìn)行對(duì)比的同時(shí)，讓學(xué)生體會(huì)到兩種生殖方式各有利弊，從而知道：人們應(yīng)當(dāng)趨利避害，取長補(bǔ)短，在植物不同的生命階段，采用不同的生殖方式以繁衍后代。在課堂中，教師還需分配更多時(shí)間、列舉更多例子來幫助學(xué)生分析和理解為了適應(yīng)環(huán)境以實(shí)現(xiàn)種族的繁衍，兩種生殖方式應(yīng)當(dāng)如何合理搭配應(yīng)用，將理論聯(lián)系生活實(shí)際，服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取已知含量的DKT供試品溶液1.0 mL，置10 mL刻度管中，共9份，每組3份，分別精密加入100 mg/L的對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6 mL，各3份，混勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，按擬訂色譜條件進(jìn)樣20μL，測定峰面積。結(jié)果DKT的平均加樣回收率為98.22%，RSD為1.86%（n=9）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為100 mg/L的對(duì)照品溶液20μL，分別于0，4，6，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果含量的RSD為0.23%（n=6），表明DKT對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 DKT水凝膠貼劑制備[4]

稱取聚維酮K-90 2 g，EDTA 0.15 g，溶于63.05 g純化水中，加入DKT原料藥2.5 g，攪拌均勻，作為A相；取25 g甘油，依次加入促滲劑適量、甘羥鋁0.3 g、聚丙烯酸Viscomate NP-800 5 g，攪拌均勻，作為B相，處方總量100 g。取大小合適的攪拌鍋，加入B相，攪拌15 min后倒入A相，繼續(xù)攪拌1.0 h，靜置0.5 h，均勻涂于無紡布上，蓋上背襯，室溫放置2 h，即得。每片貼劑剪裁為5 cm×10 cm大小，含DKT 0.25 g，含藥膏質(zhì)量10 g。

2.3 體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)[4]

圖1高效液相色譜圖

取處理好的Wistar雄性大鼠腹部離體全皮，固定于改良Franz擴(kuò)散池（有效擴(kuò)散面積為1.5 cm2）的兩室之間，角質(zhì)層面向供給室，將DKT水凝膠貼劑貼在皮膚角質(zhì)層面上。接受池中加入50 mL PBS緩沖液（pH=7.4）作為接受液，保持磁力攪拌速率為300 r/min，恒溫水浴為（32±0.5）℃。分別于試驗(yàn)開始后的1，2，4，6，8，10，12，24 h從接受池中取樣0.5 mL，同時(shí)補(bǔ)充0.5 mL PBS緩沖液。樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算藥物濃度，根據(jù)公式[Qn=其中，A為有效擴(kuò)散面積，V為取樣體積，V0為接受液總體積，Cn和Ci分別是第n個(gè)和第i個(gè)取樣點(diǎn)的藥物濃度]，計(jì)算藥物單位面積的累積經(jīng)皮滲透量（Qn），以Qn對(duì)時(shí)間作圖，并對(duì)直線進(jìn)行線性回歸，直線的斜率為滲透速率。

2.4 不同促滲劑對(duì)DKT水凝膠貼劑透皮吸收的影響

2.4.1 促滲劑種類及濃度選擇

常用的促滲劑包括有機(jī)溶劑類（乙醇、丙二醇、醋酸乙酯、二甲基亞砜及其同類物質(zhì)）、有機(jī)酸、脂肪醇類（油酸、亞油酸、月桂醇）、氮酮及其同系物、表面活性劑、角質(zhì)保濕與軟化劑類（尿素、水楊酸、吡咯酮類）、萜烯類（薄荷醇、樟腦、檸檬烯）等。參考文獻(xiàn)[5-13]，選擇常用促滲劑尿素、油酸、氮酮、薄荷醇、丙二醇及N-甲基吡咯烷酮考察其對(duì)DKT水凝膠貼劑透皮吸收的影響。促滲劑常用劑量結(jié)合試驗(yàn)中的實(shí)際情況，設(shè)置以下不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行試驗(yàn)：5%，10%的尿素；3%，5%的油酸；2%，4%的氮酮；3%，5%的薄荷醇；10%，20%的丙二醇；3%，5%的N-甲基吡咯烷酮。

2.4.2 一元促滲劑的影響

按2.4.1項(xiàng)下選擇促滲劑及不同質(zhì)量濃度，以不加促滲劑作為空白對(duì)照組，計(jì)算其累積透過量、穩(wěn)態(tài)滲透速率及促滲倍率。結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，除尿素外，油酸、氮酮、薄荷醇、丙二醇及N-甲基吡咯烷酮對(duì)DKT均有一定促滲作用。以4%氮酮的作用最強(qiáng)，10%丙二醇作用次之，促滲效果依次為4%氮酮＞2%氮酮＞10%丙二醇＞5%薄荷醇＞5%丙二醇＞5%油酸＞5%N-甲基吡咯烷酮＞3%薄荷醇。而尿素則顯示了一定程度的抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。

表1一元促滲劑作用下的DKT透皮滲透速率（n=3）

根據(jù)一元促滲劑試驗(yàn)結(jié)果選擇合適的促滲劑進(jìn)行聯(lián)用，參考文獻(xiàn)[14-16]，丙二醇具有較好促滲作用，又能增加DKT的溶解度，故主要考察丙二醇與其他促滲劑聯(lián)合使用的效果。根據(jù)2.4.2項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)置以下試驗(yàn)組：5%油酸+10%丙二醇、5%尿素+10%丙二醇、4%氮酮+10%丙二醇、5%薄荷醇+10%丙二醇及5%N-甲基吡咯烷酮+10%丙二醇。按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行體外透皮滲透試驗(yàn)，以不加促滲劑作為空白對(duì)照組，計(jì)算其累積透過量、穩(wěn)態(tài)滲透速率及促滲倍率。結(jié)果見表2。可見，丙二醇聯(lián)合其他促滲劑的促滲效果明顯優(yōu)于單一促滲劑，其中以4%氮酮+10%丙二醇聯(lián)合使用促滲透作用最強(qiáng)，其促滲倍率提高至無滲透促進(jìn)劑的3.22倍。

表2多元促滲劑作用下的DKT透皮滲透速率（n=3）

2.5 DKT水凝膠貼劑藥代動(dòng)力學(xué)研究[17-18]

2.5.1 色譜條件[19]

色譜柱：Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：5 mol/L磷酸鹽緩沖溶液-乙腈（73∶27，V/V）；測定波長：260 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：35℃。

2.5.2 血漿樣品處理

取比格犬血漿200μL，置離心管中，加入10μL萘普生鈉內(nèi)標(biāo)溶液（250μg/mL），振蕩，混勻。加入0.1 mL鹽酸（0.1 mol/L），渦旋混勻1 min，加入乙醚3 mL，渦旋混勻3 min。吸取上清液2 mL置離心管中，40℃氮?dú)鈨x吹干。殘?jiān)尤?00μL甲醇溶解，渦旋混勻1.0 min，12 000 r/min離心5.0 min，取上清液20μL，0.22μm微孔濾膜濾過，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。

2.5.3 方法專屬性考察

圖2高效液相色譜圖

取DKT對(duì)照品100 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 000μg/mL的DKT對(duì)照品貯備液。用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100，50，10，5，2.5，1.25，0.625μg/mL的對(duì)照品系列溶液，置4℃下保存，備用。取萘普生鈉對(duì)照品100 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 000μg/mL的萘普生鈉對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為250μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置4℃下保存，備用。分別取比格犬空白血漿，加有DKT和內(nèi)標(biāo)萘普生鈉對(duì)照品貯備液的空白血漿和樣品血漿，按2.5.2項(xiàng)下方法處理，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。可見，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾DKT及內(nèi)標(biāo)萘普生鈉的測定，DKT的保留時(shí)間為10.45 min，內(nèi)標(biāo)萘普生鈉的保留時(shí)間為8.23 min。詳見圖2。

2.5.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取比格犬空白血漿200μL，分別加入2.5.3項(xiàng)下對(duì)照品系列溶液20μL，配成10，5，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按2.5.2項(xiàng)下方法處理，測定DKT與萘普生鈉的峰面積。以DKT的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、DKT與萘普生鈉的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=17 862X-2 438.6（r=0.998 2）。結(jié)果表明，DKT質(zhì)量濃度在0.062 5～10.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：分別取比格犬空白血漿200μL若干份，加入不同質(zhì)量濃度的DKT對(duì)照品溶液，制成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（5，0.5，0.125μg/mL）的血漿樣品，混勻后按2.5.2項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析。每個(gè)質(zhì)量濃度配制3個(gè)樣本，連續(xù)測定3 d，日內(nèi)及日間各重復(fù)5次。結(jié)果的RSD均小于4.86%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：將高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品分別于室溫放置24 h、-20℃冰箱保存24 h、凍融循環(huán)（-20℃）3次后，分別按2.5.2項(xiàng)下方法處理。結(jié)果血漿樣品DKT含量的RSD均小于4.92%（n=5），表明24 h內(nèi)血漿樣品穩(wěn)定性良好。

提取回收率試驗(yàn)：取高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（5，0.5，0.125μg/mL）的血漿樣品，按2.5.2項(xiàng)下方法處理，取20μL進(jìn)樣，得DKT峰面積為A1，另取DKT相同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣，所得峰面積為A2，依法計(jì)算提取回收率。結(jié)果提取回收率在92.52%～94.68%之間。

2.5.5 給藥方案與血樣采集

取健康比格犬6只，隨機(jī)分為兩組，每組3只，一組為無促滲劑DKT水凝膠貼劑，另一組為DKT水凝膠貼劑（含4%氮酮+10%丙二醇）。給藥前2 d于犬左上腹部剃毛，飼養(yǎng)待用，腹部剃毛區(qū)緊密貼敷DKT水凝膠貼劑，給犬穿上棉質(zhì)背心以防貼劑被撕落。給藥前12 h禁食不禁飲。分別于給藥前和給藥后0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，16，20，24 h時(shí)從犬前肢內(nèi)側(cè)下靜脈取血2 mL。按2.5.2項(xiàng)下方法處理，HPLC法測定血藥濃度，并繪制血藥濃度-時(shí)間（C-t）曲線，見圖3。可見，DKT水凝膠貼劑的達(dá)峰時(shí)間較長，且能較長時(shí)間內(nèi)維持較高血藥濃度，具有緩釋藥特征；兩者0～24 h藥時(shí)曲線下面積（AUC0→24h）差異顯著，含促滲劑的DKT水凝膠貼劑是無促滲劑的2.48倍，表明兩者體內(nèi)促滲倍率達(dá)2.48倍，含4%氮酮+10%丙二醇促滲劑的DKT水凝膠貼劑具有較好的透皮吸收性能。

圖3右旋酮洛氛氨丁三醇在比格犬體內(nèi)平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖（n=3）

采用DAS2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)兩組貼劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析，行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DKT水凝膠貼劑給藥后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線均符合二室模型。與無促滲劑組相比，DKT水凝膠貼劑達(dá)峰濃度（Cmax）及AUC0→24h均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3比格犬給藥后主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n=3）

表3比格犬給藥后主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n=3）

注：與DKT水凝膠貼劑（無促滲劑）比較，*P＜0.05。tmax為達(dá)峰時(shí)間，Cmax為峰濃度，t1/2α為分布相半衰期，t1/2β為消除相半衰期，AUC為血藥濃度-時(shí)間曲線下面積，MRT為平均滯留時(shí)間。

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3 討論

對(duì)于透皮性差的藥物，促滲劑發(fā)揮著重要作用，選擇合適的促滲劑是制劑研究中非常重要的一環(huán)。目前，促滲劑既可單獨(dú)使用，也可聯(lián)合使用。本研究中考察了一元促滲劑及多元促滲劑對(duì)DKT水凝膠貼劑的影響，結(jié)果表明，聯(lián)合使用促滲劑的促滲效果明顯優(yōu)于單一促滲劑。其中，4%氮酮聯(lián)合10%丙二醇的促滲透作用最強(qiáng)。氮酮主要作用于細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層，對(duì)生物膜類脂具有特異性溶解和破壞作用，能增加類脂膜的不連續(xù)性，對(duì)親水性藥物的促滲作用較強(qiáng)。丙二醇增加促滲劑及藥物溶解度的同時(shí)可發(fā)揮協(xié)同作用，可滲入皮膚，溶解α-蛋白，并與之形成氫鍵，減少α-蛋白與藥物的結(jié)合，從而促進(jìn)藥物的透皮吸收，但高濃度的丙二醇可能對(duì)皮膚產(chǎn)生傷害及刺激[20]。氮酮與丙二醇聯(lián)合使用產(chǎn)生協(xié)同作用，其促滲倍率提高至無滲透促進(jìn)劑的3.22倍，可以選擇其作為DKT水凝膠貼劑的促滲劑。以5%尿素+10%丙二醇的效果最差。尿素作為角質(zhì)層水化劑，顯示出滲透抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，作用機(jī)制尚不清楚，與丙二醇合用后，兩者的聯(lián)合促滲透作用有所提高。此外，5%油酸、5%薄荷醇及5%N-甲基吡咯烷酮與丙二醇合用后，促滲透能力均有較大幅度提升。

在DKT水凝膠貼劑的處方研究中，本研究中重點(diǎn)考察了不同促滲劑及其聯(lián)用對(duì)DKT透皮吸收的影響，以離體皮膚為參考，本研究中進(jìn)一步考察了該貼劑在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可為臨床應(yīng)用提供參考。

DKT水凝膠貼劑在比格犬體內(nèi)符合二室模型，含促滲劑組與無促滲劑組的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC0→24h分別為（26.22±1.17）mg·h/L、（10.56±0.32）mg·h/L，兩者比值為2.48，表明含促滲劑體內(nèi)促滲倍率達(dá)2.48倍，與體外試驗(yàn)促滲倍數(shù)（3.22倍）相比有差異，說明透皮吸收體內(nèi)與體外試驗(yàn)具有相關(guān)性，但有一定差異。