不同殼聚糖黏均分子量測定

朱靜毅，王 威，房克慧，尹 萌

（江蘇省揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州225001）

殼聚糖（CS）是天然來源的甲殼素脫乙酰基后得到的高分子氨基多糖，是自然界中產量僅次于纖維素的天然有機高分子材料，具有可生物降解、生物相容性好、無免疫原性等特點，廣泛應用于醫藥、食品、化工、化妝品、環保等領域[1]。殼聚糖的相對分子質量大小對其理化性質和生理活性有至關重要的影響，測定殼聚糖的相對分子質量具有重要意義[2]，測定方法包括黏度法、分子排阻色譜法、質譜法[3]、多角度激光光散射法[4]等。黏度法采用烏氏毛細管黏度計，設備簡單，操作方便，是目前較常用的方法。本研究中選取市售殼聚糖樣品，分析不同脫乙酰度及采用不同滅菌方式對殼聚糖特性黏度及黏均分子量的影響，為殼聚糖的進一步開發和應用提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試藥：殼聚糖（詳見表1）；冰醋酸（批號為20181008），36%乙酸（批號為20180725），氯化鈉（批號為20180904），均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

表1殼聚糖樣品信息

儀器：烏氏毛細管黏度計（毛細管內徑為0.5～0.6mm，上海前鋒橡塑玻璃制品廠）；水銀溫度計（范圍為0～50℃，精度為0.5℃，中華人民共和國常州熱工儀表總廠）；J9-2型秒表（精度為0.1 s，上海手表五 廠）；XS205DU型電子分析天平（精度為0.01 mg，梅特勒托利多公司）；恒溫水浴缸（精度為0.05℃，上海標本模型廠）。

1.2 方法

1.2.1 溫度調節

接通恒溫水浴缸和攪拌器電源，調節水浴溫度至（25±0.05）℃。

1.2.2溶液配制

不同濃度溶液：精密稱取殼聚糖樣品（1）100 mg，以0.2 mol/L CH3COOH-0.1 mol/L CH3COONa緩沖液作溶劑，配制成質量濃度為1 mg/mL的溶液，再逐級稀釋，依次配制成質量濃度為0.8，0.4，0.2，0.1 mg/mL的供試品溶液。

不同離子強度溶液：分別取殼聚糖樣品2，3，4，6，8各40 mg，精密稱定，各5份，置100 mL容量瓶中，分別加冰醋酸濃度為0.2 mol/L，NaCl濃度依次為0，0.05，0.1，0.2，0.4 mol/L的混合溶液溶解，定容。

不同滅菌方法樣品溶液：分別取殼聚糖樣品4～9各40 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用0.2 mol/L CH3COOH-0.1 mol/L CH3COONa緩沖液溶解，并稀釋至刻度。

不同輻照劑量樣品溶液：分別取殼聚糖樣品10～12各40 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用適量0.2 mol/L CH3COOH-0.1 mol/L CH3COONa緩沖液溶解，并稀釋至刻度。

1.2.3 溶劑流出時間測定

取潔凈干燥的烏氏黏度計，加入空白溶劑，用秒表準確讀取時間。重復測量3次，偏差應小于0.2 s，計算平均值（t0）。

1.2.4 溶液流出時間測定

取3號垂熔玻璃漏斗過濾供試品溶液，棄去初濾液1 mL，取續濾液。取供試品溶液適量，潤洗黏度計2～3次，安裝并調節好烏氏毛細管黏度計，同法測定供試品溶液的流出時間（記為t）。

2 結果

2.1 不同濃度溶液的測定結果

采用外推作圖法，取4個質量濃度[5]進行測定。各個質量濃度的相對黏度（ηr）見表2，在1.1～2.1范圍內。由表2可見，采用最小二乘法得到樣品（1）的線性回歸方程，分別為ηsp/C=392 083X+1 048.7（方程1），r=0.993 0；ln（ηr/C）=-158 561X+1 049.7（方程2），r=0.975 2。由方程1外推至濃度C=0處，得[η]=1 049.7；由方程2外推至濃度C=0處，得[η]=104 8.7，故[η]平均為1 049.2。根據一點法，[η]在919～1 060之間，誤差較大，故采用一點法經驗公式進行修正。由表3可見，經驗公式1計算得到的特性黏度值與外推法所得結果相比，偏 差 最 小[6]。根 據 經 驗 公 式[η]=KMα，式 中，K=3.72×10-5cm/g，M為相對分子質量，α=1.37[7]，計算M為274 132。

表2殼聚糖樣品（1）的實驗測定結果及數據處理結果

表3一點法經驗公式修正結果

2.2 不同離子強度溶液的測定結果

由圖1可見，NaCl的濃度對殼聚糖的特性黏度影響較大，且對相對分子質量大的殼聚糖影響更大。NaCl的濃度小于0.05 mol/L時，離子強度對殼聚糖特性黏度產生的波動較顯著，之后逐漸趨于平緩。

圖1離子強度對殼聚糖特性黏度的影響（n=5）

2.3 不同脫乙酰度及滅菌方式的測定結果

由表4可見，隨著殼聚糖脫乙酰度的增大，其特性黏度及相對分子質量依次增大[11]，采用環氧乙烷和60Co輻照滅菌均會使樣品的特性黏度降低，且呈現出脫乙酰度越大，特性黏度及相對分子質量降幅越大的趨勢[12]。

表4不同脫乙酰度及不同滅菌方式殼聚糖的相對分子質量（n=5）

2.4 不同輻照劑量殼聚糖的測定結果

由表5可見，當60Co輻照劑量為4～8 kGy時，殼聚糖相對分子質量降低幅度依次增大。

表5不同輻照劑量殼聚糖相對分子質量（n=5）

3 討論

3.1 溶液濃度選擇

殼聚糖樣品的相對分子質量越高、溶液濃度越小，一點法測得溶液特性黏度的相對誤差越小，質量濃度在0.2～0.4 mg/mL時，計算得到的特性黏度值相對誤差絕大多數在5%以內。實際操作中，取0.2 mol/L CH3COOH-0.1 mol/L CH3COONa緩沖液作為溶劑，殼聚糖溶液質量濃度為0.4 mg/mL，用一點法測得的特性黏度相對誤差最小（0.18%），故首選其溶液質量濃度為0.4 mg/mL。

3.2 溶劑選擇

由于殼聚糖不溶于水和堿性溶液，也不溶于硫酸和磷酸，但可溶于乙酸溶液，形成透明黏稠的殼聚糖膠體溶液[13]。故考察離子強度的影響時，選擇NaCl-CH3COOH混合溶液為實驗溶劑。

3.3 外推法與一點法比較

殼聚糖的黏度計算一般采用外推法與一點法。外推法需配制系列不同濃度（通常為5個）的殼聚糖供試品溶液，通過測定不同濃度（C）下的殼聚糖樣品的相對黏度（ηr）與增比黏度（ηsp），計算、作圖，外推至C=0處則可得到特性黏度[η]。一點法只需測1個濃度下的ηr和ηsp，即可計算出殼聚糖的特性黏度，進而求得其黏均相對分子質量。需要注意的是，在應用一點法測定殼聚糖樣品特性黏度時，需運用一點法經驗公式進行修正，以減小實驗誤差。

3.4 高效液相色譜分析結果

曾考察高效液相色譜凝膠分析系統來進行殼聚糖相對分子質量的測定。色譜條件：島津LC-20AD型高效液相色譜儀，RI檢測器，色譜柱為SRT? SEC-500型（300 mm×7.8 mm，5μm，500?），柱溫為25℃，流動相為0.2 mol/L CH3COOH-0.1 mol/L NaAc緩沖液（pH4.3），流速為1.0 mL/min，進樣體積為10μL。結果，殼聚糖相對分子質量范圍較大，大分子量部分被排阻，小分子量部分被滲透，導致未能成功檢測。

3.5 注意事項

配制溶液時，必須保證其完全溶解，否則會影響溶液起始濃度，導致結果偏低[14]。溫度是高分子溶液黏度測試中最敏感的物理因素，故測試系統中必須適時監控不同位點的溫度，以便適時調控溫度[15]，確保測定溫度穩定在（25±0.05）℃。實驗中要選擇合適的梯度溶液濃度，確保溶液流出時間超過100 s。