柚皮苷微乳制備工藝研究*

徐坤勇，郭建忠，顏 娟，韻國萍

（1.河北省張家口市第一醫院藥劑科，河北 張家口075061；2.河北北方學院附屬第一醫院藥劑科，河北 張家口075061）

柚皮苷又稱柚苷、柑橘苷，來源于蕓香科柑橘屬植物柚、葡萄柚未成熟或近成熟的干燥果皮，是一種天然的黃酮類化合物[1]。柚皮苷具有多種生物學活性，包括抗過敏反應[2]，抗氧化，調血脂，抑制雜環胺類物質等致突變性，抗癌，預防與治療胃潰瘍，對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希桿菌及某些真菌有抑制作用，抗炎，對某些毒物有拮抗作用，解痙，鎮痛，改善微循環和軟骨組織細胞功能，降低毛細血管通透性和骨關節病變率等[3]。微乳劑可緩慢釋放藥物，提高藥物生物利用度，達到協同增效和減毒的目的[4]。本研究中擬利用柚皮苷的生物學活性，制備柚皮苷微乳，并對其外觀、形態、粒徑表征和穩定性進行觀察，為柚皮苷制劑的進一步開發奠定基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JB-2型恒溫磁力攪拌器（上海智光儀器儀表有限公司）；KQ-250DE型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度及Zeta電位測定儀（英國Malvern公司）；SKY-2102C型恒溫搖床（常州金壇精達儀器制造有限公司）；LG16-B型高速離心機（北京雷博爾離心機有限公司）；752型紫外可見分光光度計（上海恒平科學儀器有限公司）；HH-2型數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；JEM-2100型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；AE/240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為萬分之一）。

1.2 試藥

柚皮苷對照品（重慶對照品科技有限公司，批號為110722-201312，純度≥98%）；柚皮苷（實驗室自制，純度≥90%）；丙二醇辛酸酯（法國Gattefosse公司，批號為58748-27）；油酸乙酯（批號為Z16D8Y50961），肉豆蔻酸異丙酯（IPM，批號為Y20J8S40186），均購自上海源葉生物科技有限公司；聚山梨酯80（Tween80，天津市光復精細化工研究所，批號為20171101）；聚氧乙烯35蓖麻油（EL-35，批號為D1216A），聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH-40，批號為S0824A），均購自德國BASF公司；聚乙二醇400（PEG400，批號為20121201），無水乙醇（批號為20171103），均購自西隴化工股份有限公司；1，2-丙二醇（南京威爾化工有限公司，批號為20170901）；甘油（天津市恒興化學試劑有限公司，批號為20160522）；甲醇、乙酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 油相選擇

色譜條件與系統適用性試驗[5-7]：色譜柱為Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為36%乙酸-甲醇-水（4∶49∶51，V/V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為283 nm；柱溫為室溫；進樣量為10μL。理論板數按柚皮苷峰計應不低于3 000。

油相中柚皮苷平衡溶解度：將過量的柚皮苷分別加入含有不同油相（IPM，油酸乙酯、丙二醇辛酸酯）的離心管中，漩渦振蕩5 min，混合均勻，超聲處理30 min，置40℃恒溫搖床中水平振搖48 h以達平衡，4 000 r/min離心10 min，取上清液，用適量甲醇稀釋，用0.45μm微孔濾膜濾過，依法進樣測定。結果顯示，柚皮苷在油酸乙酯中的平衡溶解度最高（4.76 g/L），故選擇油酸乙酯為油相。

2.2 表面活性劑與助表面活性劑配伍試驗

分別以Tween80，EL-35，RH-40為表面活性劑，以1，2-丙二醇、PEG400、甘油與無水乙醇為助表面活性劑，固定總質量為1.0 g，將油酸乙酯、表面活性劑與助表面活性劑按質量比1∶3∶1混合，40℃恒溫水浴攪拌均勻，得油相混合物，逐滴滴入4 mL水，形成微乳。取微乳，4 000 r/min離心15 min，靜置1 h，觀察分層現象。按公式物理穩定性參數（KE）=（A0-A）/A0測定微乳的KE。式中，A0和A分別為原微乳和原微乳離心后下層液經同倍稀釋后在同一波長下的吸光度。在相同條件下，KE越小，微乳越穩定。以283 nm為檢測波長，采用紫外分光光度法考察表面活性劑與助表面活性劑的配伍情況，結果見表1。Tween80和1，2-丙二醇、甘油制備的微乳經離心后均已分層，當Tween80，EL-35，RH-40分別為表面活性劑，PEG400、無水乙醇為助表面活性劑時均能形成澄清透明的微乳，KE較小，且4000r/min離心15 min后無分層，常溫避光靜置24 h后乳化穩定。通過配伍試驗初步選擇Tween80，EL-35與RH-40為表面活性劑，選擇PEG400、無水乙醇為助表面活性劑。

表1表面活性劑與助表面活性劑的配伍試驗結果

2.3 微乳制備及偽三元相圖繪制

按一定比例將表面活性劑與助表面活性劑混勻，作為混合表面活性劑，再將油相加入混合表面活性劑中，混勻，40℃恒溫磁力攪拌器攪拌（轉速為100 r/min），混勻，同時向混合體系中緩慢滴加水，觀察體系由清至濁或由濁至清的現象。以流動性好、外觀均一透明及有丁達爾效應為微乳形成的判斷標準。以混合表面活性劑為1個頂點，以水相和油相為另外2個頂點，根據形成微乳臨界點時各組分所占比例確定在相圖中的位置，采用Origin8.5軟件繪制偽三元相圖，確定微乳區的面積[8]。

2.4 微乳處方篩選

空白微乳制備：固定油相為油酸乙酯不變，分別選用Tween80，EL-35，RH-40為表面活性劑，選用PEG400、無水乙醇為助表面活性劑，表面活性劑與助表面活性劑質量比（Km）分別為1，2，3，按2.3項下方法制備空白微乳，觀察并記錄在臨界點時各組分所占比例。

表面活性劑選擇：分別以Tween80，EL-35，RH-40為表面活性劑，以無水乙醇為助表面活性劑，Km取3，制備混合表面活性劑，按2.3項下方法繪制微乳的偽三元相圖，確定微乳區，結果見圖2。可見，當EL-35為表面活性劑時微乳區面積最大，故選擇EL-35為表面活性劑。

助表面活性劑選擇：固定表面活性劑為EL-35，其Km為3，分別以PEG400、無水乙醇為助表面活性劑，按2.3項下方法繪制微乳的偽三元相圖，確定微乳區，結果見圖3。可見，當無水乙醇為助表面活性劑時微乳區面積最大，故選擇無水乙醇為助表面活性劑。

Km值選擇：以表面活性劑為EL-35，以無水乙醇為助表面活性劑，以Km分別為1，2，3制備混合表面活性劑。按2.3項下方法繪制微乳的偽三元相圖，確定微乳區，結果見圖3。可見，當Km=3時微乳區面積最大，故選擇Km為3∶1。同時，油酸乙酯與混合表面活性劑質量比為1∶4時能形成穩定的微乳，故確定油酸乙酯與混合表面活性劑質量比為1∶4。

圖1不同表面活性劑繪制的偽三元相圖

圖2不同助表面活性劑繪制的偽三元相圖

圖3不同Km繪制的偽三元相圖

2.5 微乳制備

乳化溫度選擇：分別稱取油酸乙酯0.2g、EL-350.6g與無水乙醇0.2 g，按2.3項下方法分別于40，50，60℃恒溫磁力攪拌（轉速為100 r/min）下逐滴滴入4 mL水，制備空白微乳。以微乳外觀性狀、透光率為考察指標，觀察乳化溫度對乳化效果的影響，結果見表2。隨著乳化溫度的升高，微乳透光率逐漸降低。40℃乳化時所得微乳澄清透明，常溫靜置24 h仍保持穩定，無分層現象。故選擇乳化溫度為40℃。

表2乳化溫度對乳化效果的影響（n=3）

稀釋倍數（W水∶W油）確定：分別稱取油酸乙酯0.2 g、EL-35 0.6 g與無水乙醇0.2 g，按2.3項下方法分別滴入1，4，8，16 mL水，制備空白微乳。以微乳外觀性狀與透光率為考察指標，觀察不同稀釋倍數對乳化效果的影響，結果見表3。隨著稀釋倍數的增大，微乳的透光率逐漸升高。當水≥4 mL（即稀釋倍數≥20倍）時，均能形成澄清透明的微乳，透光率均＞90%，常溫靜置24 h仍保持穩定。故選擇水與油的質量比為20∶1。

表3稀釋倍數對乳化效果的影響（n=3）

2.6 空白微乳處方確定

由篩選結果可知，油酸乙酯為微乳油相，EL-35為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，Km為3。確定空白微乳處方組成比例為油酸乙酯4%，EL-35 12%，無水乙醇4%，水80%。

2.7 柚皮苷微乳處方確定

稱取適量柚皮苷，加入油酸乙酯中，按2.3項下方法制備含柚皮苷0.5%，1%，2%的微乳，于4 000 r/min離心15 min，于離心前后分別測定微乳中柚皮苷的含量。結果離心前后柚皮苷含量無明顯變化，所制備的柚皮苷微乳穩定性良好。為了保持更高的載藥量，故選擇含2%柚皮苷的微乳為目標處方，進而確定柚皮苷微乳處方組成比例為柚皮苷2%，油酸乙酯4%，EL-35 12%，無水乙醇4%，水78%。

2.8 柚皮苷微乳表征

性狀：黃棕色透明、流動性好的低黏度液體。

形態觀察：取柚皮苷微乳適量，用水稀釋20倍，滴在銅網上，靜置10 min，用濾紙吸走多余的水，用2%磷鎢酸（pH7.4）溶液負染10 min，自然揮干，置透射電子顯微鏡下觀察，結果見圖4。該微乳顆粒呈圓球形，分布相對均勻，基本無粘連現象。

圖4 柚皮苷微乳透射電鏡圖（×80 000）

粒徑分布與Zeta電位測定：取適量柚皮苷微乳，加水稀釋，超聲分散，采用激光粒度測定儀于25℃測定柚皮苷微乳粒徑分布，結果見圖5；Zeta電位分析儀測定電位分布，結果見圖6。柚皮苷微乳的平均粒徑為（32.78±0.30）nm，均在10～100 nm之間；Zeta電位平均值為（-47.86±4.71）mV。

pH測定：稱取柚皮苷微乳0.5 g，加水稀釋100倍，于25℃測定pH，結果為5.37。

圖5柚皮苷微乳的粒徑和Zeta電位分布

2.9 初步穩定性考察

高溫試驗：取適量柚皮苷微乳，密封保存于帶塞西林瓶中，60℃恒溫水浴鍋中分別放置5 d和10 d，考察柚皮苷微乳的穩定性，結果見表4。放置5 d，微乳已變渾濁，透光率明顯下降，表明柚皮苷微乳在高溫時質量不穩定。

表4 60℃穩定性試驗結果（n=3）

常溫留樣考察：取適量柚皮苷微乳，密封保存于帶塞西林瓶中，在溫度25℃、相對濕度75%條件下分別放置1，2，3，6個月，定期考察，結果見表5。第6個月柚皮苷微乳仍保持澄明，未見分層，透光率及含量與第0個月比較均無明顯變化。

表5常溫留樣考察結果（n=5）

3 討論

柚皮苷單體具有良好的成藥性[9]。目前，有代表性的柚皮苷制劑為片劑[10]，但存在首過效應，生物利用度不高[11]。微乳為良好的藥物載體，可提高藥物的生物利用度[12]。因此，本研究中制備柚皮苷微乳考察其表征形態及穩定性，為柚皮苷制劑的進一步開發提供參考。

油相是微乳的重要組成部分，本研究中通過平衡溶解度篩選油相。偽三元相圖是研究微乳體系的基本工具，微乳區域面積與微乳穩定性關系密切[13]。EL-35含聚氧乙烯基團，為非離子型表面活性劑，可降低界面膜的表面張力，有較好的乳化性能，不易受酸堿的影響，毒性小，溶血性低[14]，且形成的微乳區面積較大，故選擇EL-35為表面活性劑。助表面活性劑可調節表面活性劑親水親油平衡值，同表面活性劑降低界面張力有協同作用，增加微乳的流動性，增強界面間的柔性，且因短鏈醇類能增大藥物的溶解度，減小微乳顆粒，乳化性能好，常作為助表面活性劑使用[15]，故本研究中選擇無水乙醇作為助表面活性劑。

高溫試驗結果表明，柚皮苷微乳在60℃放置5 d后，外觀明顯渾濁，這可能與柚皮苷在熱水中溶解度急劇升高，柚皮苷從油相中轉入水相，破壞微乳結構有關，表明柚皮苷微乳制劑應常溫或低溫貯藏。由常溫留樣考察試驗結果可知，柚皮苷微乳放置6個月后未見分層，透光率和含量未見明顯變化，表明柚皮苷微乳在25℃放置6個月穩定性良好。

綜上所述，本方法所制備的柚皮苷微乳可為擴大柚皮苷的應用奠定基礎，但能否滿足臨床需求，提高藥物療效，還需要通過后續試驗考察和驗證。