高效液相色譜法測定清補通絡丸中丹酚酸B含量*

邱遠金，王 林，周衛剛，宋海龍，李江濤，劉紀杉，李曉瑾，高 輝，朱國強

（1.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊830002；2.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊830054；3.新疆維吾爾自治區第六人民醫院，新疆 烏魯木齊830013）

布魯氏桿菌病（Brueellosis）簡稱布病，是一種由革蘭陰性桿菌[布魯氏桿菌屬細菌（Brucella）]侵入機體后引起的變態反應性傳染病[1]，分為急性期和慢性期，急性期主要采用西藥治療，慢性期提倡中藥治療，中醫針對病因病機辨證給予具有補氣扶正、活血化瘀、清熱祛濕、通絡止痛等功效的中藥治療[2-3]。清補通絡丸由丹參、黨參、黃芪、獨活等15味中藥組方，丹參為君藥。丹參富含丹參酮ⅡA、丹酚酸B、丹參素等化學成分，其中丹酚酸B（Sal B）是標志性有效成分之一，含量較高（≥3.0%）[4]，且對照品易于獲取，目前研究得最多；丹酚酸B具有改善缺血、缺氧所致的心肌細胞損傷，抑制心血管收縮、抗動脈粥樣硬化等藥理活性，故選擇丹酚酸B作為含量測定的指標性成分[5-10]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定清補通絡丸中丹酚酸B含量，并進行方法學考察，旨在為有效控制藥物的質量和保障用藥安全提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SK5200HP型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為140 W，頻率為42 kHz）；AB265-S型電子分析天平（梅特勒-托利多國際貿易＜上海＞有限公司，精度為十萬分之一）；Ultimate3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾公司）。

1.2 試藥

丹酚酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為WKQ18042503）；清補通絡丸（新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，自制，規格為每10丸重1.4 g，批號分別為20170321，20170322，20170323）；甲醇、乙腈均為色譜純；磷酸為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE 5 Super C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（22∶78，V/V）；檢測波長：286 nm；流速：1.2 mL/min；進樣量：10μL；柱溫：25℃。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取丹酚酸B對照品適量，置50 mL容量瓶中，加甲醇-水（8∶2，V/V）溶液溶解，定容，得質量濃度為306.2μg/mL（即0.306 2 mg/mL）的對照品溶液。

供試品溶液：取樣品適量，粉碎，稱取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇-水（8∶2，V/V）混合溶液50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率為140 W，頻率為42 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇-水（8∶2，V/V）混合溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：取缺丹參的陰性對照品0.5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性及陰性干擾試驗：分別取對照品溶液、供試品溶液、缺丹參的陰性對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。結果丹酚酸B對照品峰與供試品溶液丹酚酸B峰的保留時間一致，陰性對照品溶液在相應位置處未出現丹酚酸B吸收峰，且丹酚酸B色譜峰與其他組分色譜峰分離完全，表明處方中其他藥材對丹酚酸B的含量測定無干擾。

圖1高效液相色譜圖

線性關系考察：分別精密吸取2.2項下對照品溶液1，2，3，5，10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇-水（8∶2，V/V）溶液定容，精密吸取10μL，注入色譜儀，按擬訂色譜條件測定，以峰面積（Y）為縱坐標、丹酚酸B質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.177X-5.856 1，r=0.997 5（n=6）。結果表明，丹酚酸B質量濃度線性范圍為30.62～360.20μg/mL。

精密度試驗：吸取同一對照品溶液（306.20μg/mL）10μL，重復進樣6次，按擬訂色譜條件測定峰面積。結果峰面積的RSD為0.63%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液10μL，按擬訂色譜條件分別于0，2，4，8，16，24 h時測定丹酚酸B的峰面積。結果峰面積的RSD為1.24%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：精密稱取同一批（批號為20170321）樣品6份，依法制備供試品溶液，并測定丹酚酸B含量。結果平均含量為10.783 9 mg/g，RSD為1.70%（n=6），表明方法重復性良好。

耐用性試驗：分別考察不同流速、不同柱溫、不同流動相比例、不同波長、不同型號色譜柱對丹酚酸B含量的影響。結果柱溫、流速、流動相比例、檢測波長、色譜柱等條件微小變化時，供試品中丹酚酸B含量的檢測結果無明顯差異，表明該方法的色譜條件耐用性良好。

加樣回收試驗：稱取同一批（批號為20170321，丹酚酸B含量為10.783 9 mg/g）樣品6份，各0.25 g，精密稱定，分別精密加入10 mL對照品溶液（質量濃度為0.306 2 mg/mL）和40 mL甲醇-水（8∶2，V/V）溶液，依法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液，按擬訂色譜條件測定峰面積，計算平均回收率和RSD。結果見表1。

表1丹酚酸B加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品（批號分別為20170321，20170322，20170323），按丹酚酸B含量測定方法進行測定。結果3批樣品丹酚酸B的含量分別為10.976 7，10.852 7，11.262 0 mg/g，平均含量為11.030 5 mg/g，RSD為1.90%（n=3）。

3 討論

丹酚酸B含量的測定方法有HPLC法、紅外光譜法、毛細管電泳法[11]，其中HPLC法較常用[12-16]。清補通絡丸是醫院制劑，臨床反映療效良好。本研究中參考2015年版《中國藥典（一部）》，建立了檢測清補通絡丸中丹酚酸B含量的HPLC法，并進行方法學驗證。本方法測定結果穩定，分離效果較好，陰性對照對試驗結果無干擾，可用于測定清補通絡丸中丹酚酸B的含量。清補通絡丸由多味中藥組方，成分復雜，為更好控制其質量，還需要建立其他有效成分含量檢測方法。