丹桃養肝丸質量標準研究*

張 紅，孫婷婷，劉 洋，薛敬冬，李粉萍，楊 琳

（1.陜西省中醫藥研究院，陜西 西安710003；2.陜西省中醫醫院，陜西 西安710003；3.陜西省楊凌示范區醫院藥劑科，陜西 咸陽712100）

肝纖維化是各種慢性肝炎發展為肝硬化前共有的可逆性病理組織學改變，若不給予有效的抗肝纖維化治療。丹桃養肝丸是陜西省中醫醫院國家名老中醫藥專家、陜西省名中醫成冬生主任醫師治療慢性乙型肝炎肝纖維化的經驗方。慢性乙型肝炎為正虛邪戀，正虛以氣虛為主，進一步發展會出現血瘀等，氣虛而血瘀，而肝體陰而用陽，主藏血。丹桃養肝丸依據以活血化瘀為本、益氣養血柔肝兼重的防治肝纖維化理論基礎，治療慢性乙型肝炎肝纖維化，臨床療效顯著，為科室診療常規方案。為擴大臨床使用范圍，使更多患者受益，擬將該方開發為醫療機構制劑。本研究中采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別該制劑中的丹參、當歸、黃芪3味藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法對方中君藥丹參的主要化學成分丹酚酸B進行了含量測定，為該產品的質量控制提供客觀的定性定量評價方法?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Secura125-1CN型電子分析天平（d=0.01 mg），Quintix244-1CN型電子分析天平（d=0.1 mg），均購自北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 試藥

丹桃養肝丸（醫院制劑，批號分別為170801，170802，170803）；黃芪甲苷對照品（供含量測定用，批號為110781-201314），丹酚酸B對照品（供含量測定用，批號為111562-201313），丹參對照藥材（批號為120923-201414），均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈（色譜純，Fisher公司）；其他試劑均為分析純，均購自國藥集團；丹參、當歸、黃芪藥材購自陜西興盛德藥業有限責任公司，經陜西省中醫藥研究院中藥研究所楊智峰研究員鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

丹參[1]：取樣品2 g，粉碎成細粉，置錐形瓶中，加2滴鹽酸和20 mL 70%甲醇，超聲處理15 min，離心取上清液，水浴蒸干，加甲醇1 mL溶解，制得供試品溶液。同法制備缺丹參的陰性對照品溶液。取丹參對照藥材1 g和丹酚酸B對照品，同法制得對照藥材溶液和對照品溶液（含丹酚酸B 0.5 mg/mL）。分別吸取上述4種溶液點于同一聚酰胺薄膜上，點樣量為2μL，以丙酮-36%乙酸-濃氨（10∶25∶2，V/V/V）為展開劑，展開，在紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中檢出丹酚酸B及丹參，陰性對照無干擾。見圖1 A。

當歸[2]：取樣品3g，粉碎成細粉，置錐形瓶中，加30mL乙醚，超聲提取10 min，濾過，揮干乙醚，加乙醇1 mL溶解，制得供試品溶液。同法制備缺當歸的陰性對照品溶液及對照藥材溶液。分別取上述3種溶液各10μL，點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1，V/V）為展開劑，展開，在紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中檢出當歸，陰性對照無干擾。見圖1 B。

黃芪[3]：取樣品細粉7 g，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水50 mL溶解，用水飽和的正丁醇提取，提取液依次用1%NaOH溶液、水溶液洗滌2次，蒸干，加少量水溶解，加D101型大孔樹脂柱頂，依次以50 mL水、30 mL 40%乙醇洗脫雜質，棄去，最后以50 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，加1 mL甲醇溶解，制得供試品溶液。同法制備缺黃芪的陰性對照品溶液。取黃芪甲苷對照品適量，加入甲醇，得質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。分別吸取上述3種溶液各5μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）的下層溶液為展開劑，展開，用10%硫酸乙醇溶液顯色，105℃加熱顯色。供試品溶液色譜中檢出黃芪甲苷，陰性對照無干擾。見圖1 C。

2.2 丹酚酸B含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色 譜 柱：M05CLA25 Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm。理論板數按丹酚酸B峰計應大于6 000。

2.2.2 溶液制備

取樣品細粉0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，超聲提取30 min，放冷，用溶劑補足減失的質量，搖勻，微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，備用。

同法制備缺丹參的陰性對照品溶液[4-5]。精密稱取丹酚酸B 10.6 mg，溶于10 mL甲醇，得質量濃度為0.106 mg/mL的對照品溶液，避光保存。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2項下3種溶液10μL，按擬訂色譜條件檢測。結果丹酚酸B色譜峰分離良好，陰性對照無干擾，色譜圖見圖2。

線性關系考察：精密量取丹酚酸B對照品溶液，置容量瓶中，用甲醇稀釋，得質量濃度為0.005 3 mg/mL的溶液，精密吸取2，4，6，8，10μL，按擬訂色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=21 838X-21 321，r=0.999 8。結果表明，丹酚酸B進樣量在0.212～1.060μg范圍內與峰面積線性關系良好。

圖2高效液相色譜圖

精密度試驗：取丹酚酸B對照品溶液10μL，按擬訂色譜條件重復進樣6次。結果丹酚酸B峰面積的RSD為0.43%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取2.2.2項下供試品溶液6份，按擬訂色譜條件進樣測定。結果丹酚酸B含量的RSD為1.91%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為170801），依法制備供試品溶液，取10μL，于室溫下測定12 h內的穩定性（每隔2 h測定1次）。結果丹酚酸B峰面積的RSD為2.78%（n=6），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

加樣回收試驗：取樣品（含量為7.604 9 mg/g）0.5 g，共9份，分別加入質量濃度為0.524 mg/mL的丹酚酸B對照品溶液2，2，2，4，4，4，6，6，6 mL，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1丹酚酸B加樣回收試驗結果（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為170801，170802，170803）樣品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果丹酚酸B含量分別為7.69，7.79，7.64 mg/g，平均含量為7.71 mg/g。

3 討論

3.1 定性鑒別中對照品選擇

丹參、當歸和黃芪分別為方中君、臣、佐藥。丹參活血化瘀、養血止痛、涼血消腫，針對慢性乙型肝炎肝纖維化中醫證候瘀血阻絡之主證，為君藥；當歸補血、活血、止痛，主治血虛諸證，瘕積聚、虛寒腹痛等，加強君藥活血化瘀，養血柔肝之功效，為臣藥；黃芪益氣養血，治療氣血兩虛之兼證，為佐藥[6]。丹參中主要有效成分為脂溶性的丹參酮類[7]和水溶性的丹酚酸B、丹參素等[8]。當歸藥材中含有主要化學成分包括揮發性成分如藁本內酯、苯乙酮、十二醇、庚烷、烷烴等，其他如阿魏酸、維生素類、尿嘧啶、腺嘌呤等[9]，其成分復雜，特征性成分不明顯。黃芪主要有效成分以黃芪甲苷為代表[10]。因此，以丹參及丹酚酸B為對照品鑒別丹參，以當歸藥材為對照鑒別當歸，以黃芪甲苷為對照品鑒別黃芪。所建立的方法可從丹桃養肝丸樣品中檢出丹參及丹酚酸B、當歸、黃芪甲苷，陰性對照無干擾。

葉下珠為方中佐藥，味苦、性寒，歸肝經，清熱利濕，解毒平肝，現代常用于慢性病毒性肝炎及肝纖維化的治療[11-12]。病毒性肝炎病因共識為濕熱疫毒為患，本方取其寒涼清利之性，直清肝經濕熱，針對慢性乙型肝炎濕熱內蘊而設。葉下珠藥材中含有沒食子酸、甲氧基鞣花酸、柯里拉京等多種化學成分[13]。以葉下珠藥材為對照鑒別葉下珠，采用50%甲醇為提取溶劑，超聲提取，再用乙酸乙酯提取制備樣品溶液。曾選擇硅膠G薄層板，甲苯-三氯甲烷-丙酮-甲酸（8∶5∶7∶2，V/V/V/V）為展開劑；硅膠G薄層板，冰醋酸-乙醇-乙酸乙酯-甲酸（8∶6∶2∶0.5，V/V/V/V）為展開劑；硅膠GF254薄層板，三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（3∶5∶1，V/V/V）為展開劑。結果或分離效果較差，或陰性對照有干擾，故未能建立葉下珠的薄層鑒別方法。

3.2 色譜條件選擇