高效液相色譜法同時檢測安神補腦膠囊中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷含量*

江 勛，彭婷婷，周 峰

（湖南省衡陽市市場監督檢驗檢測中心，湖南 衡陽421001）

安神補腦膠囊是由鹿茸、制何首烏、淫羊藿、干姜、甘草、大棗經提取后加維生素B1組成的復方制劑，具有生精補髓、益氣補血、健腦安神的功效，用于腎精不足、氣血兩虧所致失眠、健忘、頭暈、神經衰弱等癥[1]，臨床應用廣泛，療效較好，且安全性好。全國僅有4家藥品生產企業具備批準文號（分別為國家食品藥品監督管理局 標 準YBZ15322009，YBZ02542009，YBZ06762009，YBZ08452009），但其質量標準不一，均以2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量測定作為處方中制何首烏的質控指標。方中制何首烏和淫羊藿為君藥。淫羊藿始載于《神農本草經》，具有補腎壯陽、強筋健骨、祛風除濕等功效，可用于增強免疫力、治療骨質疏松、改善心肺功能[2-4]，約有55種，我國有45種[5]，其中4種收錄于2015年版《中國藥典（一部）》，分別為淫羊藿Epimedium BrevicornuMaxim、箭葉淫羊藿Epimedium Sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim、柔毛淫羊藿Epimedium PubescensMaxim、朝鮮淫羊藿Epimedium KoreanumNakai的干燥葉，性辛、溫，味甘，補腎陽，強筋骨，祛風濕[6]。不同品種、產地、采收季節的淫羊藿中的指標性功效成分淫羊藿苷含量差異較大[7-8]，可能導致不同廠家不同批次產品的療效差異。為了能更有效地對安神補腦膠囊進行質量控制，本研究中把單一指標定量控制提高到同時控制2個指標成分的含量，建立同時測定安神補腦膠囊中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷含量的高效液相色譜（HPLC）法[9]。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AT型液相色譜儀，SPD-M20A型檢測器，均購自日本島津公司；AE240S型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團公司，精度為十萬分之一）；DK-615HT型超聲波清洗儀（深圳市得康洗凈電器有限公司，功率為360 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷對照品（批號為110844-201814，純度為91.0%），淫羊藿苷對照品（批號為110737-201516，純度為94.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；安神補腦膠囊（江蘇晨牌藥業集團股份有限公司，批號分別為1804152，180523，1807092，1901072，1903082，1904012，1907122；江西南昌桑海制藥有限責任公司，批號分別為181007，181209，190120，190247；亞寶藥業集團股份有限公司，批號為190301）；乙腈（色譜純，批號為N9CA1H），甲醇（色譜純，批號為T3AG1H），均購自美國Honey Well公司；水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Shimadzu Shim-packVP-ODSC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～11 min時20%A，11～12 min時20%A～36%A，12～24 min時36%A，24～25 min時36%A～20%A，25～30 min時20%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：350 nm；柱溫：35℃；進樣量：10μL。理論板數按2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷峰計均不低于10 000。在此色譜條件下，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷與其他組分均能達到基線分離，色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷251.84μg、淫羊藿苷74.52μg的混合對照品溶液。取樣品0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率為300 W，頻率為40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按標準中的處方量及制備方法，分別制備不含制何首烏、淫羊藿的樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

陰性干擾試驗：取2.2項下3種溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。色譜圖見圖1。

線性關系考察：分別取對照品溶液適量，加甲醇稀釋成含2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷16.79，33.58，67.16，134.32，167.90，201.47，251.84μg/mL和淫羊藿苷4.98，9.93，6.62，19.86，49.68，59.61，74.52μg/mL的系列溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，分別以對照品溶液的質量濃度（X）為橫坐標、色譜峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。結果見表1。

定量限和檢測限確定：精密量取對照品溶液，用甲醇依次稀釋至由高到低的溶液，測得2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷的檢測限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。結果見表1。

圖1高效液相色譜圖

表1線性關系、定量限和檢測限考察結果

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10μL，按擬訂色譜條件連續進樣5次。結果2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷色譜峰面積的RSD分別為0.47%和0.61%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為1807092）適量，分別于配制后0，4，8，12，18，24 h時按擬訂色譜條件進樣測定。結果2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積的RSD分別為0.41%和0.62%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：精密稱取同一批（批號為1807092）樣品6份，分別依法制備供試品溶液，進樣測定。結果2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.87%和0.95%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批（批號為1807092）樣品9份，分別精密加入2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷對照品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表2。

表2加樣回收試驗結果（n=9）

2.4 樣品含量測定

取樣品約0.25 g，精密稱定，依法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液和樣品溶液各20μL，注入液相色譜儀，平行測定2次，計算2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷含量。結果見表3。

表3安神補腦膠囊成分定量測定結果（mg/g，n=12）

3 討論

3.1 測定波長選擇

紫外吸收圖譜顯示，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷最大吸收波長分別為320 nm[9]和270 nm[6]，但其色譜圖中二者對應保留時間處均有干擾峰存在。試驗表明，在350 nm波長處二者均有良好吸收，且相應保留時間處無雜質峰干擾，故選擇350 nm作為測定波長[9]。

3.2 流動相選擇

分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液的等度洗脫和梯度洗脫，結果僅乙腈-水梯度洗脫可以同時對2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷的分離都達到滿意效果，且流動相本身干擾小，穩定、可靠，故選擇乙腈-水梯度洗脫。

3.3 提取方法選擇

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷均在稀乙醇中有良好的溶解度，且提取效果佳，干擾少，故選擇稀乙醇為提取溶劑。分別考察了提取時間為20，30，40 min時二者的含量，結果30 min的提取效果最佳。

3.4 樣品分析

對收集到的12批不同廠家生產的樣品進行檢測，發現2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷含量較接近，但淫羊藿苷含量差異較大。考慮不同廠家的安神補腦膠囊功能指標成分含量差異可能與原藥材質量差異及生產工藝有關，不同品種、產地、采收季節的淫羊藿中淫羊藿苷含量差異顯著。目前，含量檢測研究多采用單一成分測定的方法，耗時、低效。本試驗中采用在同一色譜條件下同時測定2個指標成分的方法，操作簡便，效率高，結果可靠，為提升本制劑的質量標準提供了可靠依據。

3.5 方法評價

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷分別為處方中制何首烏和淫羊藿2味君藥的指標性功效成分，含量都較高，均為水溶性物質，溶出度好。前者具有調血脂、抗氧化、抗炎、提高學習記憶能力、保護神經細胞、保護血管上皮細胞等生物活性[10-11]；后者具有增強性腺功能、調節機體免疫、促進骨生長、延緩衰老，強心、降血壓、抗心律失常、增加腦血流量，抑菌、抗病毒、抗炎、降血脂、抗腫瘤等多種作用[4]。以其二者作為指標成分，采用HPLC法進行質量控制，方法簡便、準確，能更好地保證安神補腦膠囊的質量及療效。