基于轉錄組測序的西瓜果肉硬度相關基因表達分析

鄭雪夢 時月 王雪敏 馬越 趙曉燕 張超

摘 要：以脆肉型‘京欣3號西瓜和硬肉型‘甜王西瓜為樣品，評價果肉硬度表型差異，并利用轉錄組測序技術檢測2個品種間差異表達基因。結果發現，‘甜王西瓜品種果肉硬度是‘京欣3號西瓜的1.9倍，表型與‘京欣3號西瓜具有顯著性差異。轉錄組測序結果顯示，與‘京欣3號西瓜相比，‘甜王西瓜樣品有5 342個基因差異表達，其中2 360個基因上調表達，2 982個基因下調表達。差異基因主要注釋在碳水化合物代謝、信號轉導、脂質代謝等途徑，其中與果肉硬度變化的候選基因主要包括果膠酯酶、果膠裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、纖維素合酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、酸性幾丁質酶、幾丁質酶、木葡聚糖內轉葡糖基酶/水解酶和脂氧合酶基因。鈣調蛋白、乙烯反應轉錄因子、乙烯不敏感樣蛋白、WRKY轉錄因子、MYC2轉錄因子、過氧化氫酶、呼吸爆發氧化酶和脫落酸受體PYR1參與果肉細胞活動信號轉導，可能與果肉硬度相關。

關鍵詞：西瓜;硬度;轉錄組;差異表達基因

中圖分類號：S651 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2871（2020）10-015-08

Abstract： Firmness of pulp is an important index for the sensory quality and shelf life of watermelon. In this study， watermelon （Citrullus lanatue） of ‘Jingxin No. 3 variety and ‘Tianwang variety were used to analyze the firmness and differentially expressed genes by transcriptome sequencing .‘Tianwang variety showed a different firmness phenotype to the ‘Jingxin No. 3 variety with the firmness 1.9 times of that of the ‘Jingxin No. 3 variety. Transcriptome sequencing analysis showed that， a total of 5 342 genes differentially expressed was detected in ‘Tianwang variety， of which 2 360 genes were up-regulated and 2 982 genes were down-regulated compared with ‘Jingxin No. 3 variety. Differential genes were mainly annotated in carbohydrate metabolism， signal transduction， lipid metabolism and other pathways. Candidate genes that may be related to the firmness of pulp were screened. Pectinase， Pectin lyase， polygalacturonase， cellulase， cellulose synthase， β-galactosidase， β-glucosidase， acid chitinase， chitinase， xylan endoglucanase/hydrolase and lipoxygenase genes participate in cell wall degradation. Calmodulin， ethylene reactive transcription factor， ethylene insensitive like protein， WRKY transcription factor， MYC2 transcription factor， catalase， respiratory burst oxidase and abscisic acid receptor PYR1 related genes were involved in signal transduction pathways and mediate the firmness of pulp.

Key words： Watermelon; Firmness; Transcriptome; Differentially expessed genes

西瓜是葫蘆科西瓜屬（Citrullus lanatus）植物，廣泛種植于全球熱帶和亞熱帶地區。我國是西瓜的主要產區，2015年全國西瓜播種面積186萬hm2，產量為7 714萬t，占全球西瓜產量的67%[1]。目前，西瓜全基因組測序已經完成[2]，促進轉錄組測序技術在西瓜表型方面的應用，現已在西瓜果皮顏色、果實糖分積累、乙烯調控、有機酸積累和果實品質形成等[3-8]關鍵基因定位均取得一定成績。但是，轉錄組測序技術在西瓜果肉硬度方面的研究還鮮有報道。

西瓜果肉硬度是影響西瓜品質和貨架期的重要因素[9-13]，是一個多基因參與、多種代謝過程相互影響的復雜過程，與細胞壁和細胞膜的完整性，細胞內外的滲透壓平衡等因素密切相關[14]。質構分析儀可以較為客觀準確的反映果肉硬度表型，并廣泛應用于果蔬制品硬度測定，包括葡萄、萵筍、棗、甜瓜、西瓜等[15-19]。

目前，對西瓜果肉硬度的轉錄組測序研究主要集中在野生西瓜和栽培西瓜比對方面[19-21]，筆者選擇親緣關系相近，但果肉硬度表型差異較大的脆肉型‘京欣3號西瓜和硬肉型‘甜王西瓜為試驗材料，其中‘京欣3號西瓜果肉松脆，而‘甜王西瓜果肉較硬。研究以‘京欣3號西瓜作為對照組，比較果肉硬度表型間差異，并通過轉錄組測序分析差異表達基因參與的代謝途徑，以期挖掘與西瓜果肉硬度相關的關鍵基因。

1 材料與方法

1.1 材料

供試西瓜品種為脆肉型‘京欣3號，京研益農（北京）種業科技有限公司提供;硬肉型‘甜王，育種和生產單位不詳。試驗選擇新鮮、大小相近、無顯著性機械傷的果實作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 西瓜果肉取樣 試驗于2019年9月在北京市農林科學院蔬菜研究中心加工樓實驗室進行。首先用蒸餾水清洗果實表面灰塵，再在150 μL·L-1次氯酸鈉溶液中清洗2 min，蒸餾水漂洗2次，靜置瀝水。在超凈工作臺下，將西瓜縱向切開，果肉切割成邊長約3 cm的小果塊，混合均勻，裝入聚乙烯保鮮盒內，每盒約300 g，放置于4 ℃的冰箱中冷藏，隨機抽取整塊果塊，混合取樣，測定果肉硬度。在貯藏期第5天，隨機抽取整塊果塊，混合取樣，部分用于測定果肉硬度，其他果塊使用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 果肉質構測定 使用 TA-XT plus 質構分析儀的 P/5 探頭測定樣品硬度：設定最小感知力 5 g，測試前速度 10 mm·s-1;測試速度 2 mm·s-1;測試后速度 10 mm·s-1，下壓距離 10 mm，以下壓過程中平均力大小代表硬度，每次測試位置均勻，每個樣品取 5 個點，取平均值。

1.2.3 轉錄組測序 以‘京欣3號西瓜果肉作為CK組，‘甜王西瓜果肉作為HF（Hard flesh）組進行轉錄組測序，為確保轉錄組測序的準確性和可靠性，每個處理組作3次重復，分別標記為CK1、CK2、CK3、HF1、HF2和HF3。采用 TRIzol法提取西瓜總 RNA。轉錄組文庫構建、高通量測序和序列組裝工作均由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

對各樣本的對原始測序數據進行過濾，得到高質量的測序數據（clean data），與西瓜97103基因組（Watermelon_97103 ，http：//cucurbitgenomics.org/organism/1）進行序列比對。使用軟件RSEM對基因的表達水平進行定量分析，計算各基因的表達水平，定量指標為TPM（Transcripts Per Million reads）。利用DESeq2軟件進行基因差異表達分析，以P adjust < 0.05 & |log2FC| ≥ 1為標準篩選差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）。將差異表達基因與GO和KEGG數據庫進行比對，對差異表達基因進行功能富集分析，采用軟件 Goatools 進行GO富集分析，采用美吉自主研發流程對基因集中進行KEGG PATHWAY富集分析，以P adjust<0.05為閾值，滿足此條件則認為此GO功能/KEGG通路存在顯著富集情況。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel進行數據整理，利用SPSS 26.0 進行統計分析，采用Duncan新復極差法對數據進行顯著性檢驗，采用Origin 9.0 軟件繪制圖像。

2 結果與分析

2.1 西瓜果肉硬度表型分析

圖1顯示，‘京欣3號西瓜和‘甜王西瓜在貯藏期期間硬度變化情況。‘京欣3號西瓜和‘甜王西瓜具有相同的母本，屬于近緣品種，‘京欣3號西瓜果肉松脆，而‘甜王西瓜果肉較硬。測定結果顯示‘甜王西瓜果肉硬度顯著高于‘京欣3號西瓜，是‘京欣3號西瓜果肉硬度的1.9倍;在貯藏期間，‘甜王西瓜果肉硬度未見顯著性變化，而‘京欣3號西瓜的果肉硬度有顯著性的降低。因此，‘甜王西瓜果肉硬度表型與‘京欣3號西瓜具有顯著性差異。

2.2 轉錄組數據質控分析

通過Illumina平臺對‘京欣3號西瓜、‘甜王西瓜果肉樣本測序（表1），使用SeqPrep和Sickle軟件對原始測序數據進行質控，使用TopHat2和HISAT2軟件將質控后的clean reads與參考基因組比對，獲得用于后續轉錄本組裝、表達量計算等的 mapped reads，對轉錄組測序的比對結果進行質量評估。表1顯示，6個樣品共獲得 330 387 592個原始數據，通過過濾和質量控制的原始數據共產出327 389 480個的clean reads，并且配對錯誤率均小于0.025 3%，Q30堿基比例在93.87%以上，與參考基因組的比對率在74.00%以上，比對效率較高。因此，6個西瓜樣本轉錄組測序數據質量較好，可以用于后續生物學分析。

2.3 基因表達量分析

通過相關性熱圖，對樣本間基因表達量的生物學重復相關性進行評估，將皮爾遜相關系數r作為評估指標，r2越接近1，說明2個重復樣品相關性越強。圖2顯示，每個樣本間的3次生物學重復的相關性較強，其中CK組樣本的3個組間重復相關性最好。同時，對6個樣本的基因表達量進行主成分分析，找出離群樣本，判別相似性高的樣品簇。如圖3所示，相同處理的樣本之間聚集在一起，相似度較高，而不同處理之間基因表達差異顯著，分別形成不同的集群，與圖2結果一致。

2.4 差異表達基因分析

通過對不同西瓜樣本的表達基因進行比較，篩選出差異表達基因。將FC（差異倍數）≥2且P adjust < 0.05作為篩選標準，差異表達基因的數目統計如表2所示，2組間共有5 342個基因差異表達，其中2 360個基因上調表達，2 982個基因下調表達。差異基因火山圖（圖4）可以簡明地看出各組別的差異基因分布。

2.5 差異表達基因的GO功能富集

GO（Gene Ontology， http：//www.geneontology.org/）是基因本體論聯合會建立的將全世界所有與基因有關的研究結果進行分類匯總的綜合數據庫，利用GO數據庫，可以將基因按照它們參與的生物學過程、構成細胞的組分和實現的分子功能進行分類。如圖5所示，對富集程度前20的GO term做散點圖，差異基因顯著富集在寡糖的生物合成過程（14個）、海藻糖代謝過程（12個）、二糖生物合成過程（12個）、海藻糖的生物合成過程（11個）、含磷酸鹽的化合物代謝過程（389個）、磷代謝過程（391個）、寡糖代謝過程（19個）、二糖代謝過程（17個）、轉錄調節活性（102個）、磷酸化（284個）、轉移酶活性（674個）方面。

2.6 差異表達基因的KEGG富集分析

利用 KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.genome.jp/kegg/）數據庫，可將基因按照參與的pathway通路分類，通過對代謝通路的分析，更好地揭示差異表達基因的生物學功能。對‘京欣3號西瓜與‘甜王西瓜的差異表達基因進行功能富集分析，共富集到131個代謝通路中，選擇富集程度較前的代謝通路散點圖（圖6）展示。差異基因在DNA復制（23個）、果糖和甘露糖代謝（25個）、甘油脂代謝（25個）、半乳糖代謝（23個）、N-聚糖生物合成（14個）、精氨酸和脯氨酸代謝（18個）、MAPK信號傳導途徑-植物（44個）、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝（18個）、氨基糖和核苷酸糖代謝（40個）、磷酸戊糖途徑（16個）、植物激素信號轉導（83個）、糖酵解/糖異生（33個）、植物病原體相互作用（45個）、淀粉和蔗糖代謝（47個）通路富集。

2.7 與果肉硬度相關的候選基因篩選

如表3所示，根據‘京欣3號西瓜和‘甜王西瓜樣品差異基因的表達情況，篩選了一些與果肉硬度有關的基因。對篩選出的差異表達基因做層次聚類分析，如圖7所示，將具有相同或相似表達模式的基因進行聚類，圖中每列表示1個樣本，每行表示1個基因，圖中的顏色表示該基因在每個樣本中標準化處理后的表達量值，可以看出多數候選基因在‘京欣3號西瓜樣本中有更高的表達，具體基因注釋詳情見表3。

果膠酯酶、果膠裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、纖維素合酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、酸性幾丁質酶、幾丁質酶、木葡聚糖內轉葡糖基酶/水解酶、脂氧合酶基因參與細胞壁降解，且大部分基因在‘京欣3號西瓜果肉中有更高的表達，這可能是造成2個品種西瓜果肉硬度差異的主要原因。此外，還發現一些與信號轉導相關的鈣調蛋白、乙烯反應轉錄因子、乙烯不敏感樣蛋白、WRKY轉錄因子、MYC2轉錄因子、過氧化氫酶、呼吸爆發氧化酶、脫落酸受體PYR1基因在2個樣本間也有較大差異，這可能是因為信號分子與受體結合后，激活細胞內生化反應，介導細胞活動，進而對果肉硬度造成影響。

3 討論與結論

硬度是衡量西瓜果實感官和商業品質的重要指標。如果肉質太硬，則汁液偏少，口感較差;如果肉質過于酥松，則口感綿軟，爽口度下降，且不耐貯藏，貨架期短[6]。在本研究中，‘甜王西瓜果肉硬度是‘京欣3號西瓜果肉硬度的1.9倍，同時發現有2 360個上調基因和2 982個下調基因，與KEGG數據庫比對發現，差異基因注釋在碳水化合物代謝、脂質代謝、信號轉導、聚糖的生物合成與代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝方面。碳水化合物代謝可能是造成細胞壁降解的主要原因，細胞壁降解與水果軟化緊密相關，差異基因可能是通過參與果實碳水化合物代謝影響果實硬度。

植物細胞壁降解涉及原細胞壁和中層膜的一系列協調多糖修飾，果膠質是構成細胞壁和胞間層的主要成分，木葡聚糖是植物細胞壁半纖維素的主要成分，幾丁質是高等植物細胞壁中除纖維素外的重要多糖。果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶是植物細胞壁降解的關鍵酶，參與果實軟化。Chen等[22]發現，冷藏可以抑制PG、纖維素酶、β-半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶的酶活性，延緩果膠解聚，進而延緩藍莓果實軟化。沈穎等[23]發現，原果膠的降解和纖維素的水解是甜櫻桃果實軟化的關鍵因素。在本研究中發現果膠酯酶、果膠裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、纖維素合酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、酸性幾丁質酶、幾丁質酶、木葡聚糖內轉葡糖基酶/水解酶、脂氧合酶基因參與細胞壁降解，且大部分基因在‘京欣3號西瓜中有更高的表達。

脂氧合酶參與植物脂肪酸氧化，與植物的抗病和抗傷害反應密切相關。鈣調蛋白可以調節細胞內鈣離子的濃度，介導細胞活動。乙烯響應轉錄因子是植物中廣泛存在的轉錄因子，對植物的生長發育、次生代謝過程和植物的抗脅迫能力具有重要的調控作用[24]。Gao等[19]對‘PI186490和‘Sanbai品種不同的成熟階段的西瓜果肉轉錄組測序分析，發現除果膠酯酶基因、聚半乳糖醛酸酶、果膠酸裂合酶、糖基轉移酶基因、纖維素合酶、β-半乳糖苷酶基因、木葡聚糖轉移酶外，脂氧合酶基因、植物激素、轉錄因子的差異表達與西瓜果實的成熟和軟化有關。類似的，在本研究中發現鈣調蛋白、乙烯反應轉錄因子、乙烯不敏感樣蛋白、WRKY轉錄因子、MYC2轉錄因子、過氧化氫酶、呼吸爆發氧化酶、脫落酸受體PYR1相關基因參與信號轉導，介導果肉細胞活動，可能與2個品種西瓜果實的硬度表型有關。

西瓜果肉的硬度是一個多基因參與、多種代謝過程相互影響的復雜過程，研究結果從轉錄水平為解析貨架期西瓜果肉硬度變化的分子機理提供參考，為挖掘西瓜硬度相關的關鍵功能基因提供基因資源。

參考文獻

[1] 中華人民共和國農業部.中國農業統計資料（2015）[M].北京：中國農業出版社，2016.

[2] GUO S，ZHANG J，SUN H，et al.The draft genome of watermelon （Citrullus lanatus） and resequencing of 20 diverse accessions[J].Nature Genetics，2013，45（1）：51-58.

[3] 楊侃侃.基于RNA-seq技術對西瓜果皮色澤差異表達基因的分析[D].南昌：江西農業大學，2015.

[4] 任毅.西瓜果實含糖量QTL定位及糖轉運蛋白基因功能初析[D].北京：中國農業科學院，2016.

[5] 周明.西瓜果實成熟乙烯調控的生理及分子機制初探[D].北京：中國農業科學院，2017.

[6] 高磊.西瓜果肉硬度和酸味性狀的轉錄組分析及主效基因的精細定位[D].北京：中國農業科學院，2018.

[7] 王準，郭紹貴，許勇，等.栽培西瓜與野生西瓜果實發育過程中的轉錄組比較分析[J].中國瓜菜，2019，32（8）：202.

[8] 丁雙玉，許勇，郭紹貴，等.西瓜果實發育過程中轉錄組的初析[J].中國瓜菜，2019，32（8）：182-183.

[9] PERKINS-VEAZIE P，COLLINS J K.Flesh quality and lycopene stability of fresh-cut watermelon[J].Postharvest Biology & Technology，2003，31（2）：159-166.

[10] MAO L，JEONG J，QUE F，et al.Physiological properties of fresh-cut watermelon （Citrullus lanatus） in response to 1-methylcyclopropene and post-processing calcium application[J].Journal of the ence of Food & Agriculture，2006，86（1）：46-53.

[11] GONZALEZ M E，JERNSTEDT J A，SLAUGHTER D C，et al.Influence of cell integrity on textural properties of raw，high pressure，and thermally processed onions[J].Journal of Food science，2010，75（7）：409-416.

[12] 張超，蔡文倩，李云飛，等.1-MCP處理對不同品種鮮切西瓜品質的影響[J].農產品加工，2015（17）：1-4.

[13] 時月，張慧君，馬越，等.貨架陳列期紅光照射延緩鮮切西瓜品質劣變[J].中國瓜菜，2018，31（6）：11-15.

[14] 姚佳，胡小松，廖小軍，等.高靜壓對果蔬制品質構影響的研究進展[J].農業機械學報，2013，44（9）：118-124.

[15] 朱丹實.葡萄采后軟化機制及風味劣變的研究[D].沈陽：沈陽農業大學，2014.

[16] 姚佳.超高壓下萵筍質構的變化及機制研究[D].北京：中國農業大學，2014.

[17] 趙愛玲，薛曉芳，王永康，等.質構儀檢測鮮棗果實質地品質的方法研究[J].果樹學報，2018，35（5）：631-641.

[18] 潘好斌.薄皮甜瓜果實質地品質綜合評價及質地差異分析[D].沈陽：沈陽農業大學，2019.

[19] GAO Y，GUO Y，SU Z，et al.Transcriptome analysis of genes related to fruit texture in watermelon[J].Scientia Horticulturae，2020，262：109075.

[20] ZHU Q，GAO P，LIU S，et al.Comparative transcriptome analysis of two contrasting watermelon genotypes during fruit development and ripening[J].BMC Genomics，2017，18（1）：3.

[21] GUO S，SUN H，ZHANG H，et al.Comparative transcriptome analysis of cultivated and wild watermelon during fruit development[J].PLoS One，2015，10（6）：e0130267.

[22] CHEN H，CAO S，FANG X，et al.Changes in fruit firmness，cell wall composition and cell wall degrading enzymes in postharvest blueberries during storage[J].Scientia Horticulturae，2015，188：44-48.

[23] 沈穎，李芳東，王玉霞，等.甜櫻桃果實發育過程中細胞壁組分及其降解酶活性的變化[J].果樹學報，2020，37（5）：65-74.

[24] 蔡玉迎，宮鈺，王娟，等.蘋果中乙烯響應轉錄因子基因的克隆及序列分析[J].中國園藝文摘，2018，34（4）：8-10.