分子生物學在食品檢驗中的應用

秦鵬鈞

摘 要：隨著人們生活水平的提高，人們對食品安全問題越來越重視。研究和建立食源性致病菌快速檢測方法越來越受到社會的廣泛關注。本文主要從分子生物學角度綜述起在食品檢驗中的應用，包括聚合酶鏈反應（PCR）及相關技術、寡核苷酸探針技術、DNA指紋圖譜技術等。

關鍵詞：食品安全;分子生物學;食品檢測

近年來，世界各地區食品安全惡性事件頻繁發生。據報道，2020年7月29日，約旦首都安曼發生大規模食物中毒事件，導致至少700人中毒，其中一名兒童死亡。此外，因食品安全問題，美國先后召回2 800萬箱谷物早餐制品、5.5億枚雞蛋。食品安全問題給各個國家和人民帶來了巨大的損失和痛苦。

傳統培養方法檢測微生物時，受到食品環境脅迫或受損的微生物細胞通常需要在特殊的培養條件才能恢復生長，導致其難以被分離。發展及時、準確檢出食品中微生物的技術迫在眉睫，這一現象促進了以PCR等為代表的分子生物學技術在食品微生物及相關領域研究中的應用和發展。分子生物學技術具有快捷、靈敏、準確等優點，可精確確定存在于食品中的微生物種類及菌群情況。

1 聚合酶鏈反應（PCR）及相關技術

聚合酶鏈式反應是由K. Mullis建立的一種體外擴增特異DNA片段的技術。它利用變性與復性原理，使用DNA聚合酶，在引物和dNTP的參與下，在數小時內在體外對特異DNA片段進行百萬倍擴增[1]。這種技術具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點。

1.1 多重PCR技術

食品中通常含有不止一種致病菌，而普通PCR技術僅可對單一致病菌進行定量定性分析，在此技術基礎上衍生了多重PCR技術，通過對引物、溫度等條件的改變，可對兩種或兩種以上致病菌進行同時檢測，是食源性致病菌檢測的重要發展發向。Elizaquivel等運用該技術對沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行同時檢測[2]。

1.2 RT-PCT

RT-PCT（反轉錄PCR），以mRNA為模板，通過反轉錄酶逆轉錄cDNA，然后將此為模板，使用特異性引物，擴增目的序列[3]。該法可在基因表達水平層面上檢測細胞或者組織，還可以檢測細胞中RNA病毒的含量或直接擴增特定基因的cDNA等。

1.3 實時定量熒光PCR技術

該技術是將熒光分子加入反應體系中，然后通過檢測熒光信號來實時反映DNA量，可以實時觀測到PCR產物。而多重實時熒光定量PCR可實現大腸桿菌、沙門菌和金葡球菌的同時、高效共檢。相關人員利用該方法，對40份食品樣品中的單增李斯特氏菌進行了檢測，其靈敏度達只需19個細菌就可以得到陽性結果[4]。

2 以16S rRNA為靶基因進行的檢測技術

16S rRNA存在于所有原核細胞中，有較高的拷貝數，其序列中含可變區及高度保守區，因此可設計群、屬、種特異性探針進行微生物檢測。對細菌中的16S rRNA基因進行測序是當前細菌鑒定的“金標準”。馮金牛等人利用該方法對鴨疫里默氏桿菌DNA進行檢測的最小檢出量為1.907×10-5 g/L，菌液的最小檢出量為1.5×104 CFU/mL[5]。

3 DNA指紋圖譜技術

英國遺傳學家Jefferys等在1984年將人源小衛星DNA用作基因探針，同人體核DNA的酶切片段雜交，獲得了長度不等的雜交帶圖紋，因為獲得的圖紋幾乎都不相同，其個體識別能力足以與手指指紋相媲美。目前，隨著科技的發展，已衍化出多種技術。

3.1 變性梯度凝膠電泳標記技術（DGGE技術）

DGGE技術是在變性劑的作用下從而使DNA片段電泳遷移率發生變化，使片段大小相同堿基不同的DNA片段分開。在食品中微生物的分離、鑒定中使用廣泛，也可以確定生物群落的變化。Ampe等利用該技術檢測酸化木薯淀粉發酵過程中的生物群落，檢測到鏈球菌、乳球菌等微生物[6]。

3.2 溫度梯度凝膠電泳技術（TGGE技術）

TGGE技術是在DGGE基礎上進一步發展的技術，與DGGE不同的是，該技術在引物的5端加入3 050 bp的GC片段且有溫度梯度變化[7]。該技術的特點是可以發現目前尚未被認識的腸道細菌，但在食品檢驗中的應用較少。

3.3 隨即擴增多態DNA技術（RAPD技術）

RAPD技術的特點是引物隨機，擴增后會得到不同大小的DNA，通過分子標記，對不同大小的DNA進行差異性分析。該技術以整個細菌DNA基因組為對象，特異性和敏感性較高，在分子生物學研究甚少的領域或者分子生物學特征不明確或不了解基因組DNA序列的真菌和乳酸菌的檢測中都可以應用該技術。實際應用中在品種純度檢測方面應用較多。如余四斌等人利用該技術快速鑒定雜交水稻種子的純度[8]。

3.4 核糖體RNA基因分析技術

現存的所有生物基本都含有核糖體，且rRNA序列在同種生物細胞中的差異很小，在不同的生物種群中可以通過對比堿基進行分析，相應的技術方法即是核糖體RNA基因分析技術，在菌株的分離鑒定中有極大的優勢。該技術可用于副溶血性弧菌、李斯特菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等的檢測[9]。

4 分子印跡技術

1975年Southern首先提出了分子印跡的概念。原理是將一個具有特定形狀和大小的、可識別的分子作為模板分子，將其溶于交聯劑中，再加入特定的功能單體聚合物后，形成高度交聯的聚合物，其內部包埋有可與功能單體相互作用的模板分子，然后利用物理或化學方法將模板分子洗脫，這樣聚合物母板上留下了與模板分子形狀相似的孔穴，且孔穴內各功能基團的位置與所用的模板分子互補，可與模板分子發生特殊的結合作用，從而實現對模板分子的識別[10]。近年來，分子印跡技術運用十分廣泛，無論是DNA、RNA還是蛋白質層面的檢測都可運用該技術。

4.1 Western blotting

Western blotting即為蛋白質印跡法。它的原理是抗原抗體的特異性結合。將從待測樣品中提取的分子大小不同的蛋白質（抗原）混合物用凝膠電泳法分離后，將其轉移到固定支持物上，用帶有標記的抗體做探針與之雜交，通過放射自顯影等技術檢測基因表達的產物。金明國等人就是利用通過Western blotting技術準確檢測馬檳榔甜蛋白[11]。

4.2 Dot blotting

Dot blotting即為斑點印跡技術。它是一種酶免疫分析技術。它的原理是用點滴法或電斑法將抗原轉移到尼龍膜上或硝基纖維膜上。該法敏感度極高，毫/微克水平的特異性抗原也可以成功檢出。斑點印跡技術對實驗室及設備的要求低，是比較容易掌握的一門技術。楊靖亞等人利用斑點印跡法技術特異性檢測致病性副溶血弧菌，靈敏度高、操作簡單，可用肉眼判定結果[12]。

參考文獻

[1]盧生棟.現代分子生物學實驗技術[M].北京：中國協和醫科大學出版社，1999.

[2] Elizaquivel P，Aznar R.A multiplex RTi-PCR reaction for simultaneous detection of Escherichia coli O157：H7，Salmonella spp.and Staphylococcus aureus on fresh， minimally processed vegetables[J].Food Microbiology，2008，25：705-713.

[3] Cheng A，Wang M，Xin H，et al.Deveiopment and application of a reverse transcriptase chain reaction to detdct Chinese isolates of duck hepatitis virus type 1[J].Journal of Microbiological Method，2009，77：333-336.

[4]吳曉芳，韓建康，紀蕾，等.多重實時熒光PCR快速檢測沙門菌和單增李斯特菌[J].疾病監測，2011（3）：234-237.

[5]馮金牛，陳芳艷，阮二壘，等.鴨疫里默氏桿菌16 S rRNA PCR快速檢測方法的建立[J].中國獸醫科學，2010（4）：395-399.

[6] Ampe F，Ben Omar N，Moizan C，et al.Polyphasic study of the spatial distribution of microorganisms in Mexican pozol，afermented maize dough，demonstrates the need for cultivation-independent methods to investigate traditional fermentations[J].Applied and Environmental Microbiology，1999，65（12）：5464-5473.

[7]周琳，張曉君，李國勛，等.DGGE/TGGE技術在土壤微生物分子生態學研究中的應用[J].生物技術通報，2006（5）：67-71.

[8]余四斌，徐才國.用RAPD技術鑒定水稻種子純度初探[J].種子，1996（5）：56-57.

[9]肖劍.分子生物學技術在食品微生物檢測中的應用[J].廣西輕工業.2011（3）：10-12.

[10]周振中，李彩霞.分子印跡技術在食品安全檢測中的應用[J].安徽農業科學，2012（7）：3967-3972.

[11]金明國， 李雄彪. 用蛋白質印跡技術檢測馬檳榔甜蛋白[J]. 南開大學學報（自然科學版）， 1995（1）：63-67.

[12]楊靖亞，張建，趙勇，等.Western斑點印跡法檢測致病性副溶血弧菌[J].食品科學，2010（20）：413-416.