淺談提升動物實驗室血凝與血凝抑制檢測準確率的方法

肖 歡

（甘肅省兩當縣畜牧獸醫站太陽分站，甘肅 兩當 742400）

當前動物實驗室使用較頻繁的檢測方法為血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI），該試驗屬于血清診斷范疇，通過病毒體現出的凝集紅細胞特性進行試驗結果的判定。普遍被應用在已知病毒的血清檢測中，也是動物實驗室運用廣泛的實驗方法之一。此試驗檢測過程體現出特異性佳、操作簡便、可集中處理大量樣本以及對試驗環境要求簡單等優點。即便如此，該試驗檢測方法應用不當時，會對試驗結果產生嚴重影響，導致試驗失效。

1 血凝抑制試驗的常規應用

1.1 抗體水平的監測

完成疫苗免疫的雞群，HI抗體效價保持在特定水平，如果利用弱毒活疫苗對雞群進行免疫后，HI抗體的值能夠達到1：16～1：64（4㏒2～6㏒2）；如果利用油劑滅活苗對雞群進行免疫，HI抗體的值能達到1：256～1：512（8㏒2～9㏒2），頂峰時值能達到1：2048（11㏒2）。HI試驗可以被設定為有效的免疫檢測手段，可以有效避免免疫失敗情況的發生。

1.2 鑒定某些病毒

很多病毒都會對動物的紅細胞造成凝聚影響，此特性會被特異性抗血清抑制。換言之，當雞新城疫的血清與雞新城疫病毒相遇會發生中和反應，但是不會與禽流感病毒發生中和反應。基于此，血清中和實驗可以對已知病毒進行判定，還可以用于判斷雞血清中有無特異性抗體，進一步確定雞群感染新城疫的情況。

2 提升HA和HI準確率的操作

2.1 緩沖液的操作

2.1.1 緩沖液的種類。在展開血凝試驗與血凝抑制試驗時，兩者使用的緩沖液存在明顯差異，常見的緩沖液包括兩種，第一種生理鹽水；第二種磷酸鹽緩沖液。

在常規的禽流感抗體檢測檢驗中，會選用濃度85%的生理鹽水作為緩沖液，因為當生理鹽水的濃度超過85%后，容易導致紅細胞出現非特異性凝集，但是生理鹽水并不能持續具備反應系統pH值的能力。而磷酸鹽緩沖液具備此能力。利用磷酸鹽緩沖液展開禽流感抗體檢測，獲取的抗體效價與利用生理鹽水相較，體現出明顯的檢出率優勢。基于此，禽流感凝血實驗與凝血抑制檢測實驗最佳的緩沖液應為磷酸鹽。明顯提升檢出率的同時，有效避免了非特異性凝聚。需要特別指出的是，與磷酸鹽配合使用的Na2HPO4含有水分子，應合理把控用量，在滅菌處理后還需要對pH值進行調整。

2.1.2 緩沖液的pH值。無論在試驗過程中選用哪種緩沖液，都應注意合理pH值的設定。病毒血凝性最適宜的pH值應控制在6.0～7.2之間。當pH＜5.8時，紅細胞增加了聚集結塊風險，或者會發生破裂溶血現象。pH＞7.8時，聚集紅細胞發生加速解聚變化，導致原本吸附在紅細胞上的病毒脫落。如果使用生理鹽水為緩沖液，7.2＜pH＜6.4時，容易導致紅細胞破潰溶血問題的發生。綜合來講，利用磷酸鹽緩沖液展開試驗時，最佳的pH值范圍為：6.0＜pH＜7.2，而生理鹽水為緩沖液展開試驗時，最佳的pH值范圍為：6.4＜pH＜7.2。所以，為提升試驗結果精準性，可以將pH值確定在6.4～7.2之間，當pH值被確定在7.0～7.2之間時，血沉是最充分的，試驗中圖形的可辨性也是最高的，直接通過觀察可以完成精準性較高的結果判定。出于pH試紙存在誤差的考慮，可以在試驗過程中將pH值控制在7.0，此措施的有效性在眾多的試驗檢測中已經得到驗證。

2.1.3 緩沖體系統一。在整體試驗過程中，當涉及緩沖液使用時，應確保使用的緩沖液統一，特別是在1%雞紅細胞配置過程中，一定要避免生理鹽水的使用，應嚴格按照試驗所需的緩沖體系實施操作。

2.2 溫度的控制

在展開HA和HI操作時，溫度的精確控制也是提升檢測準確率的有效方法。當試驗溫度處于4～37℃范圍內時，當溫度提升5℃時，HI效價會明顯發生改變，平均提升0.35㏒2。當環境溫度達不到4℃時，會導致反應速度下降，應對反應時間適當延長。此時的紅細胞非常容易發生聚集。當環境溫度高于37℃時，抗原能活躍，會大量釋放神經氨酸酶，導致紅血球表面因為受到破壞而喪失聚散能力，最終從紅血球上脫落，最終導致溶血的發生。當溫度高于37℃時，容易因為液體蒸發過快而對反應體系、各組比例造成影響，反應體系與比例失調都會直接影響到抗原活性——下降，造成試驗失效的嚴重后果。綜前所述，試驗的最佳溫度應控制在18～22℃之間，特別是在炎熱的夏天展開試驗時，應先將試驗環境衡定在恰當溫度范圍內再展開試驗。

2.3 時間的控制

在進行測定血凝效價后，很多情況會對持續展開HI試驗產生制約，具體情況包括：隔天展開HI試驗、進行了紅細胞懸液的更換、進行了抗原的更換。當上述三種情況發生時，都需要對血凝效價進行重新測定。常規情況下，在HA試驗加入紅細胞20min后，可以隨時讀取觀察結果，直到對照孔出現100%凝集現象，空白對照孔的液體足夠清澈透亮后，再完成結果的最終判定。

在展開HI試驗過程中，孵育過程的時間與溫度成反比，最適宜試驗展開的溫度值為18～22℃之間，孵育在20～40min之間。當孵育時間不足，會導致血清中的抗體與抗原之間的反應不徹底，凝聚欠佳，導致后續紅細胞與血清中的抗體進行抗原爭奪。當孵育時間太長，抗原會釋放出大量神經氨酸酶，對紅細胞造成嚴重影響，致其脫落或裂解。所以，將孵育時間控制在20min，以陰性與陽性的對照孔反映情況為信號，陰性對照孔表現出完全沉淀，陽性對照孔表現出凝集時，對試驗結果進行觀察。淚滴徹底流淌，與對照孔的淚滴大小、淚痕流動速度、淚線粗細非常相似時，最后孔作為判定結果。