衛矛屬植物組織培養的研究進展

周茂嫦，王彩云，侯 俊，成忠均，王 永，張翔宇*

(1.畢節市中藥研究所，貴州 畢節 551700; 2.大方縣扶貧開發辦公室， 貴州 畢節 551700)

衛矛屬(Euonymus)植物為衛矛科(Celastraceae)衛矛亞科(Celastroideae)衛矛族(Euonymeae)，是衛矛族中的族式屬[1]，全屬約有850種，其品種繁多、資源豐富，是中藥研發的重要資源，主要分布于亞熱帶及熱帶地區。我國作為主產區，涉及111種、10個變種、4個變型[2]，其中約有61種被用于我國民間醫藥，主要分布于四川、貴州、甘肅、福建等省以及長江流域、華北和東北地區。衛矛屬常見有衛矛(Euonymusalatus)、膠東衛矛(E.kiautschovicus)、白杜(E.maackii)、肉花衛矛(E.carnosus)和冬青衛矛(E.japonicus)等，大部分為灌木或藤本狀灌木，少部分為喬木[3]。國內外學者在科學研究與生產實踐中仍不斷發現和鑒定變種、變型或新種。顧哲明等[4]在四川金佛及云南舊城各發現1個新種，分別命名為金佛山衛矛(E.jinfoshanensis)和木果衛矛(E.xylocour)。任繼文等[5-6]在甘肅文縣及舟曲各發現1個新種，分別命名為文縣衛矛(E.wensienensis)和狹葉衛矛(E.stenophyllus)。陳謙海[7]在貴州發現1個新種，命名為鱗果衛矛(E.furfuraceus)。

衛矛屬植物觀賞價值高，適應性強，對提高人居生態環境及凈化空氣方面有重要作用；其根皮可提取硬質橡膠，種子含油量高[8]，具有重要的經濟價值；另還具有重要的藥用價值，對腫瘤、病毒、肺心病、泌尿系統疾病及心絞痛等有一定功效[9-11]，常用于解毒、治療風濕痹痛和跌打損傷等。因此，國內外學者對該屬植物的組織培養開展了大量研究，并優化了部分常用樹種的快繁技術體系。張麗杰等[12]以帶芽莖段為外植體，經初代培養、增殖培養、生根誘導培養及煉苗移栽等建立了桃葉衛矛(E.bungeanus)的組織培養體系，并培養出再生植株。尚愛芹等[13]建立了爬行衛矛下胚軸的高頻離體再生體系；張微等[14]以帶腋芽莖段為外植體，建立了膠東衛矛的組織培養技術體系。桑新華等[15]研究了不同激素配比及濃度、不同外植體對膠東衛矛組織培養的影響。另外，也有學者研究了扶芳藤(E.fortune)[12-17]、雷公藤(Tripterygiumwilfordii)[18-22]、南蛇藤(Celastrusorbiculatus)[23]、美洲南蛇藤(Celastrusscandens)[24]、絲棉木(E.maackii)[25-26]及肉花衛矛[27]的組織培養和快繁技術。但目前大部分衛矛屬植物的組織培養體系并不完善，且普遍存在種胚、葉片愈傷組織分化困難，褐化率高、易污染、生根難及煉苗成活率低等問題。鑒于此，為衛矛屬植物的資源保護及開發利用提供依據，從其組織培養外植體、基本培養基、培養條件和植物生長調節劑的篩選，及組培苗的馴化移栽等方面對衛矛屬植物組織培養相關研究進行綜述，指出存在的問題，提出未來的研究方向。

1 衛矛屬植物組織培養的影響因素

1.1 外植體

1.1.1 外植體的選擇 選擇合適的外植體是組織培養成功的前提。雖然植物的很多部位都可作為組織培養的外植體，但不同的外植體再生能力不同。衛矛組織培養通常使用葉片、帶腋芽莖段及種胚為外植體，根據外植體及培養途徑可劃分為愈傷組織誘導、莖段培養及胚培養等。

劉非燕等[27]利用肉花衛矛的帶頂芽莖段、子葉和根段為外植體，成功誘導出完整植株；祖慶學等[28]以火焰衛矛(E.alatusCompacta)成熟胚培養長出的子葉為外植體，建立了一套完整的離體再生體系；尚愛芹等[29]研究發現，以爬行玉矛(E.fortuneivarRadicans)無菌苗下胚軸為外植體，芽原基可以直接產生于子葉下胚軸的表皮細胞，無需通過愈傷組織誘導分化即可直接形成不定芽。桑新華等[15]研究發現，膠東衛矛的莖段比葉片更容易誘導出愈傷組織，并且容易分化成苗。CHEN等[30]試驗發現，10 d的鬼箭羽芽苗60%的子葉和70%的下胚軸在WPM+5.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基上可誘導出2～4個芽。研究表明，通過不同培養途徑均能獲得再生植株，以帶腋芽莖段及種胚為外植體更容易誘導形成再生植株，且再生率高，而以葉片為外植體誘導愈傷組織，較難分化出不定芽。

1.1.2 取材時間 在植物組織培養中，不同取材時間的相同外植體滅菌效果及誘導率均不同。吳琰等[31]研究寬瓣衛矛、圓瓣衛矛和膠東衛矛不同時間段外植體的培養情況發現，3—4月寬瓣扶芳藤腋芽萌發時取材消毒，污染率最低，萌芽所需時間最短，萌發率最高，培養效果最好。周魏等[32]研究發現，雙歧衛矛宜選4月下旬較嫩的帶芽莖段為外植體材料。張家勛等[33]研究發現，種子的發育情況與接種時間有關，9月10日、9月30日接種時，種胚發育完整。為最佳接種時間。王曉花等[34]研究表明，衛矛種子采種時間晚可提高種子萌發率；劉繼生等[35]研究發現，延長桃葉衛矛種子采收時間有利于提高萌發率。

1.1.3 外植體的消毒 外植體采集后需要進行消毒處理。目前，常用的消毒劑有酒精、0.1%升汞、抗生素及次氯酸鈉(2%～5%)等，且聯合使用消毒劑更有利于降低污染率，常用消毒組合為75%酒精+次氯酸鈉或75%酒精+0.1%升汞。由于升汞等消毒劑對植物材料有毒害，在消毒過程中易殘留，因此，應注意把握用量并妥善處理。祖慶學等[28]研究發現，火焰衛矛成熟種子消毒5 min，種胚嚴重染菌；消毒10 min和12 min，未發現種胚污染，但處理14 d后，消毒12 min的種子部分種胚死亡，無法誘導胚狀體，而消毒10 min的種子14 d后誘導生長出具有綠色子葉及下胚軸的完整胚狀體。桑新華等[15]研究發現，膠東衛矛帶腋芽莖段用5% 次氯酸鈉消毒，3 d后莖段開始污染，而用10%和15%次氯酸鈉消毒的莖段未發現污染，綜合考慮成本及次氯酸鈉對外植體的殺傷作用，建議選用10%的次氯酸鈉溶液進行消毒。余慧等[36]研究表明，次氯酸鈉和酒精結合使用消毒效果優于使用單一消毒劑；先使用75%酒精消毒30 s，再用3%次氯酸鈉消毒3～21 min，外植體誘導率呈先升后降趨勢，18 min時誘導率最大。趙麗蒙[37]研究發現，氯化汞與吐溫-20結合使用可大幅降低污染率。綜上所述，衛矛屬植物外植體消毒一般選用次氯酸鈉、75%乙醇和氯化汞等消毒劑，且大多先用75%酒精消毒20～90 s，然后再用0.1%～0.15%氯化汞或2%～15%次氯酸鈉溶液進行較長時間消毒。另外，由于同一物種不同的外植體或不同物種的外植體所需消毒試劑及其濃度、消毒時間均不同，因此，應根據外植體材料的種類、潔凈程度、生長環境及生長期等選擇適宜的消毒試劑進行不同時間和濃度的消毒處理，這是衛矛屬植物離體快繁技術體系建立的關鍵。

1.2 基本培養基

組織培養技術體系建立的基礎是適宜的培養基，其中的無機鹽種類及濃度是關鍵因子。篩選適宜不同衛矛屬植物的基本培養基一直是衛矛組織培養體系建立的一項核心內容。李軍正[38]研究發現，MS培養基更適宜庫普曼衛矛愈傷組織的萌發，采用MS培養基誘導愈傷組織其誘導時間最短且質地緊密、長勢良好，各項指標均優于1/2MS和WPM培養基。祖慶學等[28]研究表明，WPM和MS培養基培養的愈傷組織接種14 d內長勢無差異；30 d后愈傷組織增殖速度和生長狀況出現差距，WPM培養基的愈傷組織增殖速度較慢，質地致密、綠色，而MS培養基的愈傷組織質地疏松、淡綠色，增殖速度較快；培養50 d后，MS培養基培養的愈傷組織有少量不定芽分化，而WPM培養基培養的愈傷組織分化率高，且有子葉直接分化出芽，暗示WPM培養基更有利于火焰衛矛愈傷組織誘導及芽分化。趙麗蒙[37]研究表明，基本培養基會影響不定芽增殖，其效果依次為White

1.3 休眠處理

由于衛矛種子的特殊性，在利用衛矛種子為外植體開展組織培養工作時，需進行前處理。研究發現，沙藏、層積、胚乳遠端切除等方式均有助于衛矛種子打破休眠，提高發芽率。趙麗蒙[37]研究發現，未去除假種皮的衛矛種子萌發率為0，去除假種皮的沙藏種子在MS+2.0 mg/L GA3培養基中的萌發率最高。有研究證明，庫普曼衛矛和桃葉衛矛的種子假種皮中存在某種能夠抑制種子萌發的物質，其假種皮存在時，種子萌發率均為0[35，38]，可見假種皮是影響種子萌發的重要因素，而沙藏能夠起到催芽作用，打破種子休眠。龍建華等[39]研究發現，沙藏處理后清水浸泡24 h的疏花衛矛(E.laxiflorus)種子出土時間最早、出苗率最高，平均出苗率為56%。王曉花等[34]研究證實，經隔年埋藏層積處理后，種子的萌發率高達96%。劉繼生等[35]研究提出，低溫層積可以打破種子休眠。陳鈞林[40]研究發現，肉花衛矛種子休眠的主要原因是其種皮透氣性差使種子的呼吸作用受到抑制，而采用層積變溫處理可明顯增加種子透氣性，提高種子發芽率。張家勛等[33]研究發現，陜西衛矛(E.schensianus)種子遠端切除1/4～1/3體積胚乳有利于萌發及出苗。可能原因：一是打破了堅硬種皮的包裹，二是胚乳是儲存養分的“源”，其受到損傷刺激時，儲存的養分會向子葉“庫”流動，從而促進各器官的生長發育。

1.4 植物生長調節劑

植物生長調節劑及附加物是影響組織培養的主要因素之一，不同植物生長調節劑對衛矛組織培養的影響差異很大。

1.4.1 種子萌發及種胚誘導途徑 衛矛組織培養過程中，種子萌發及種胚誘導受多種激素的影響。趙麗蒙[37]研究發現，GA3濃度為2.0 mg/L時，最適宜種子萌發；在種胚誘導進程中，單獨添加NAA有利于誘導根毛生長，添加1 mg/L 6-BA時不定芽的誘導率有提升。張家勛等[33]研究發現，陜西衛矛種子在MS+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA培養基中生長情況最好。THAMMINA等[41]研究發現，衛矛植株的三倍體胚乳組織在培養基MS+2.2 μM BA+2.7 μM NAA中先暗培養8周再光培養4周，能成功誘導出綠色愈傷組織；之后在MS+4.4 μM BA+0.5 μM IBA培養基上培養8周后誘導出不定芽，最終成功誘導出三倍體無籽再生植株。張麗杰等[12]研究發現，1/2MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂為成熟胚萌發的最適培養基。BIAHOUA等[42]研究提出，不同類型、濃度的糖及培養基滲透壓均可影響歐洲衛矛(E.europaea)體細胞胚胎的誘導，表現為葡萄糖濃度升高時體細胞誘導率降低，而蔗糖濃度升高時體細胞誘導率增大；當添加350 mM蔗糖或89 mM葡萄糖時，體細胞胚誘導量最大。

1.4.2 愈傷組織誘導及分化 衛矛屬植物外植體可通過愈傷組織脫分化、再分化等器官間接發生途徑再生形成完整植株。在衛矛屬植物愈傷組織的誘導與分化過程中，添加適宜的6-BA、NAA、2，4-D、KT等生長調節劑可提高誘導和分化效率。余慧等[36]研究發現，6-BA對歐洲衛矛葉片愈傷組織的誘導效果優于TDZ(噻苯隆)，愈傷組織質量更優。袁云香[43]以陜西衛矛葉片和莖段為外植體，探討影響陜西衛矛愈傷組織誘導的因素發現，不同濃度的激素處理同一外植體其生長情況不同，不同外植體的愈傷組織誘導情況也存在差異。祖慶學等[28]研究發現，火焰衛矛愈傷組織在WPM+6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA培養基上生長良好，質地致密，顏色深綠，誘導率較高且有利于芽的分化。桑新華等[15]研究發現，添加2，4-D和KT的培養基上誘導愈傷組織無法分化成苗；而添加IBA和6-BA的培養基上誘導愈傷組織質地較為緊密，多呈塊狀，表面粗糙，顏色深綠或淺綠，不用更換培養基便可直接分化出叢生芽及不定芽。胡麗娟[44]試驗表明，MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA為愈傷組織誘導的最佳培養基，誘導率高達95%以上；MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA為愈傷組織增殖的最佳培養基，愈傷組織重量可達2.269 5 g；MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA為愈傷組織分化芽的最佳培養基，分化率為95.26%。袁云香[43]研究發現，再分化培養基中添加3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+5 mmol/L Ca2+，陜西衛矛愈傷組織再分化率明顯提高。

1.4.3 幼嫩莖段誘導 目前，莖尖培養技術在陜西衛矛、雙岐衛矛等多個衛矛屬植物上利用已獲得成功。趙麗蒙[37]研究發現，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+7.0 g/L瓊脂的培養基上衛矛莖段不定芽的誘導率最高，為70.67%；通過極差分析得出MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L培養基上不定芽的增殖效果最高，增殖系數高達23.51。胡麗娟[44]將陜西衛矛的幼嫩莖段接種到MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基上，光照培養8 d左右，腋芽開始萌動并逐漸伸長；25 d左右，腋芽伸長至2～3 cm，同時莖段基部開始膨大，形成黃綠色的愈傷組織。

1.4.4 不定芽誘導 衛矛屬植物組織培養中，常添加NAA、IBA等生長素和6-BA、KT等細胞分裂素誘導不定芽。趙麗蒙[37]研究表明，1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA為不定芽增殖的最佳激素配比。桑新華等[15]建立膠東衛矛再生體系發現，生長素與細胞分裂素配比為1∶10時，莖段可誘導出愈傷組織并分化成不定芽。祖慶學等[28]研究發現，在WPM+6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA培養基中火焰衛矛的愈傷組織能分化出大量生長旺盛的不定芽，且誘導效果最好，誘導率高達68.8%。另外，莖段和種胚均在6-BA與NAA濃度配比較高時表現誘導率增加，不定芽數增多，表明高濃度細胞分裂素+低濃度生長素有利于不定芽的形成[45]。

1.4.5 生根培養 以1/2MS為基礎培養基，輔以一定濃度的IBA、IAA及NAA，較有利于衛矛屬植物生根培養。袁云香[46]研究發現，在添加高濃度NAA及AgNO3的培養基組合中，平均根數較多、根長較長；其中，1/2MS+3.0 mg/L NAA+0.05 mg/L AgNO3培養基最有利于陜西衛矛生根，生根率達86.27%，且平均生根數、平均根長顯著優于其余處理。但趙麗蒙[37]研究發現，添加GA3對衛矛生根有顯著效果，當濃度為0.4 mg/L時，生根率最高，為72.5%；添加量為0.2 mg/L時，平均生根數最多，為5.1條。

1.5 煉苗與移栽

組培苗移栽成活率與栽培基質息息相關。為提高衛矛屬植物組培苗的移栽成活率，煉苗移栽時通常選用草木灰、腐殖土、蛭石和河沙等通氣性及保水性較強的栽培基質。周魏等[32]研究發現，雙岐衛矛組培苗移栽到滅菌后的細沙+蛭石+珍珠巖(1∶1∶1)基質中，適當遮陰、保濕，移栽成活率達75%。張麗杰等[12]研究提出，移栽前進行2～3 d的煉苗，使小苗逐漸適應外界環境，然后將已生根的無菌苗移栽到盛有細沙+草炭土(1∶2)的容器中，10 d后小苗生長健壯，成活率高達100%。劉非燕等[27]研究發現，肉花衛矛無菌苗在無菌蛭石+珍珠巖(1∶1)的基質中，成活率達91%。李春玲等[47]研究提出，草炭+蛭石+珍珠巖(5∶3∶2)為絲綿木最佳生根基質，移栽成活率為85.48%，生根率為95.6%。趙麗蒙[37]研究發現，蛭石+2 500 mg/L IAA為衛矛試管外生根的最佳條件，平均根數為5.3條，生根率達100%；由正交試驗極差分析得出生根劑、濃度和基質對衛矛生根的影響依次為濃度<生根劑<基質。煉苗基質中蛭石培養效果最好，草木灰效果最差。

2 存在的問題

2.1 污染

污染是植物組織培養過程中普遍存在且很難避免的問題，主要由細菌和真菌造成，細菌污染表現為培養基表面外植體周圍出現油污狀、水污狀氣泡或乳白、紅色等菌落，通常具有臭味，一般接種1～3 d后即可發現；而真菌污染表現為污染位置長有各種顏色的霉菌，通常接種3～15 d后才會被發現，因此外植體生長是否正常需要15 d左右才能判斷[48]。另外，按照污染源可分為內源性污染和外源性污染。通常外源性污染可通過嚴格控制環境條件、小心操作進行控制；內源性污染主要從外植體材料消毒、添加抗生素等方面控制，是最難控制的污染源[49]。春季陽光充足，降雨量少，不利于微生物生長，此時取材消毒效果較好；夏秋季節空氣濕度大，溫度高，最有利于微生物滋生，消毒難度增大。在自然狀態下外植體材料表面附著的微生物隨著暴露時間的延長逐漸增多，染菌率增高[38，50]。為降低衛矛組織培養過程中的污染率，一般于晴天采集外植體，并優先選用生長旺盛且污染較少的部位，如幼胚芽、未成熟的合子胚等。BARRERA-GUERRA等[51]研究發現，添加一定濃度的慶大霉素、利福平或四環素等抗生素可降低外植體污染率。雖然抗生素有一定的抑菌效果，但容易分解、失活，且并不適用于所有菌種，使用濃度不當還會影響外植體生長。

2.2 外植體褐化率高

衛矛屬植物體內含有豐富的醌類、酚類成分，其在組織培養過程中不斷積累擴散，損傷外植體，嚴重影響快繁體系的建立。外植體的取材時間、取材部位、所用消毒劑、生理狀態、培養條件及受傷程度等對褐化有影響[52]。因此，可通過選用適宜的培養基、適宜的外植體、添加活性炭等防褐化劑、連續轉移外植體及預處理試驗材料等方式減少褐化。祖慶學等[28]研究發現，在培養基中添加0.5～1.0 g/L活性炭，不僅能縮短火焰衛矛組織培養的繼代時間，而且還能顯著降低褐化率。ENCINA等[53]研究發現，添加活性炭能降低外植體的褐化率。雖然添加活性炭可在一定程度上抑制褐化，但需控制用量，否則會對外植體產生負面影響。另外，防褐化劑雖然可在一定程度上降低褐化率，但對部分褐化現象較嚴重的植物效果不顯著。所以，需要從分子及生理機理方面深入探討褐化機制，以從根本上解決褐化問題。

2.3 組培苗生根難

誘導組培苗生根是植物組織培養中一個極其復雜的生理生化過程，影響培養材料生根的因素主要有取材部位、外植體基因型、培養條件、植物生長調節劑及培養基類型等。衛矛生根培養是其快繁體系的關鍵環節，但衛矛組培苗生根難度大，主要體現為一些品種生根率低，難以獲得完整植株[37]，如歐洲衛矛、鬼箭羽等。因此，如何獲得有優良根系的衛矛組培苗是其組織培養急需解決的一大難題。

2.4 組培苗移栽成活率低

衛矛屬植物組培苗移栽成活率較低，其原因一是組培苗根系較脆弱，移栽時易折斷；二是組培苗移栽后易感病而死亡。因此，在建立衛矛屬植物組織培養快繁技術體系時需提高組培苗適應環境的能力以及不定根質量，以提高移栽成活率，為衛矛產業的規模化發展奠定基礎。

3 展望

衛矛屬植物藥用價值、經濟價值以及觀賞價值較高，在入藥、園林綠化中得到廣泛應用。隨著衛矛屬植物組織培養技術體系的建立及優化，膠東衛矛、陜西衛矛等部分衛矛屬植物已經能夠規模化育苗，但內生菌污染及褐化問題普遍存在，且處理成本較高、方式較繁瑣，不利于商業化發展，因此還需進一步探索更加簡便、低廉的解決方法。

就衛矛組織培養技術而言，其胚乳培養與葉片等外植體誘導存在分化困難、成苗率低等問題，再生植株技術仍不夠成熟。因此，今后還需要加強葉片、胚乳誘導培養方面的研究。另外，雖然有關衛矛屬植物組織培養的研究已有大量報道，但集中于冬青衛矛、膠東衛矛和火焰衛矛等，鬼箭羽、栓翅衛矛等許多藥用價值、經濟價值很高的品種卻未見報道，該屬植物組織培養研究還具有巨大的發展空間。因此，有關衛矛屬不同種植物組織培養技術的研究還需加強。此外，可以將生理生化、基因工程、分子生物學等方面的研究與組織培養技術相融合，以促進衛矛資源的保護及開發利用。