腺相關病毒介導的腦源性神經營養素對脊神經結扎大鼠的鎮痛機制

黃愛蘋 章巧琪 谷楨 薛純純 王開強 謝磊

1上海中醫藥大學附屬市中醫醫院疼痛科（上海200071）；2上海中醫藥大學附屬曙光醫院寶山分院腎內科（上海201999）

神經病理性疼痛是由于軀體感覺系統的損傷或疾病所引起的疼痛［1］，以自發性痛、燒灼樣痛、痛覺過敏和痛覺超敏為特征，在普通人群中的患病率高達7% ～10%，長期的疼痛會嚴重影響生活及情感［2］。腦源性神經營養素（brain?derived neu?rotrophic factor，BDNF）參與神經損傷后神經修復、再生，影響繼發神經病理性疼痛的產生和維持。目前大多研究集中在內源性BDNF對神經病理性疼痛形成抑制的研究，而對中后期神經病理性疼痛的影響報道較少，特別是外源性BDNF。研究證實腺相關病毒（adeno?associated virus，AAV）介導的外源性BDNF在海馬表達可緩解炎性疼痛及自發性疼痛［3-4］，在鞘內表達可以改善慢性坐骨神經壓迫大鼠的疼痛［5］，但鞘內表達的鎮痛機制研究未見報道。有研究表明脊髓損傷后BDNF可由抑制逆轉上調鉀離子?氯離子共轉運體2（potassium chloride cotransporter 2，KCC2）活性，維持γ?氨基丁酸（γ?aminobutyric acid，GABA）功能而產生鎮痛［6］。因此，本研究通過鞘內注射AAV介導的BDNF于脊神經結扎（spinal nerve ligation，SNL）大鼠，觀察注射前后SNL大鼠痛閾值變化及注射后BDNF、KCC2在脊髓背角的表達情況，探討AAV介導的BDNF對神經病理性疼痛的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選取體質量200 ～250 g雄性SD大鼠56只，由上海西普爾?必凱實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK（滬）2018?0006。隨機分7組，每組8只，分別為正常組、SNL組、SNL+生理鹽水組（NS）、SNL+空載組（AAV0）、SNL+AAV?BDNF組（BDNF）、SNL+AAV?BDNF+KCC2拮抗劑組（BDNF+Furos）、SNL+AAV?BDNF+NS組（BDNF+NS）。

1.2 主要試劑及儀器BDNF抗體（ab203573，Abcam，USA），KCC2抗體（ab134300，Abcam，USA），Westorn?blot鼠二抗（M21001F，abmart，USA），BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010，碧云天），蛋白marker（10?250KD）（26619?1，Fermentas，CAN），ECL發光液（OH188466A，Thermo，USA），足底觸覺測定儀（IITC，USA），足底熱痛敏測定儀（Ugo Basile，ITA），切片機（MR2076，Leica，DEU），全自動化學發光圖像分析系統（Tanon?4200，Tanon），GEL im?age system（Tanon?1000，Tanon）。

1.3 AAV 載體的構建帶有BDNF的基因片段的質粒PCR擴增回收，正向引物：5′?tccatagaagacacc?gggatccgccaccATGTCTGACCCCAGTGCCTG?3′，反向引物：5′?atccttgtagtcgttaattaaggtaccTCTTCCCCTTTT?AATGGTCA?3′。擴增后與載體pHBAAV?CMV?MCS?3flag?T2A?ZsGreen（購自Hanbio Biotechnology）酶切后進行連接反應，轉化、挑菌、PCR鑒定測序。將制備的pHBAAV2/9?BDNF?GFP及其輔助包裝載體質粒pAAV?RC、pHelper，分別進行高純度抽提，共轉染AAV?293細胞，轉染后6 h更換為完全培養基，72 h后收集富含腺相關病毒顆粒的AAV?293細胞。反復凍融裂解細胞，收集上清液，利用全能核酸酶處理和柱純化方法，得到高滴度的純化腺相關病毒顆粒HBAAV2/9?BDNF?GFP，熒光定量PCR法測定滴度。

1.4 SNL 模型建立以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，以L5/6棘突間隙為中心做一長約4 cm縱向切口，逐層分離至椎板、關節突，咬除左側L5椎板和關節突，暴露分離左側L5脊神經并結扎。充分沖洗止血，逐層縫合，肌注青霉素預防感染。造模后48 h測機械痛低于造模前30%為造模成功。

1.5 鞘內注射造模成功48 h后，大鼠3%異氟烷吸入麻醉，一手定位L5/6棘突間隙，16G粗針破皮，另一手持微量注射器，按Mestre報道的方法刺入蛛網膜下腔，穿刺成功可見典型鼠尾甩動。相應試劑于10 s內推完。異氟烷吸入停止后動物在1 min內恢復翻正反射。NS、AAV0、BDNF、BDNF+Furos、BDNF+NS各組分別注射NS 10 μL、AAV0（1×1010）10 μL、AAV?BDNF（1×1010）10 μL、AAV?BDNF（1 × 1010）10 μL+KCC2拮抗劑15 μg、AAV?BDNF（1×1010）10 μL+NS 15 μg。

1.6 機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）、熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）測定注射前后各時間點上午8：00～11：00，分別測定患側足底MWT、TWL值。Von Frey測定法測定MWT（足底觸覺測定儀最大碰觸力50 g），熱平板法測定TWL（熱源的強度設定為75%，時間上限30 s）。連續測3次，每次間隔5 min，取其平均值。

1.7 取材及Westom blot 檢測行為測試后，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，開胸，通過心臟用生理鹽水、4%多聚甲醛磷酸緩沖液灌注固定。取L4?L6脊髓腰膨大入4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定30 min（4 ℃），-80 ℃低溫冰箱保存。取適量組織液氮研磨，冰上裂解1 h，4 ℃離心取上清加入5× Loading Buffer，100 ℃煮沸10 min，離心后電泳。電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上，室溫封閉1 h，稀釋后一抗4 ℃孵育過夜，洗膜3次，室溫稀釋二抗孵育1 h，洗膜3次，于保鮮膜上ECL底物反應液反應60 s，瀝干，曝光成像。

1.8 統計學方法本實驗采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。行為學數據采用重復測量方差分析，計量資料以均數±標準差表示。多組間樣本均數比較進行方差齊性檢驗，使用單因素方差分析，方差齊者兩兩比較采用t檢驗。Western?blot實驗結果用Image?Pro Plus 6.0軟件統計分析；應用Graph Pad Prism 5.0軟件進行數據圖制作。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠注射前后MWT、TWL 比較觀察發現造模前各組大鼠基礎MWT、TWL值無明顯差異。注射后各組MWT、TWL逐漸降低，至注射后7 d，SNL、NS、AAV0各組趨于穩定，BDNF、BDNF+Furos、BDNF+NS各組逐漸回升，與正常組比較差異有統計學意義（P ＜0.001）。注射后14、21 d，BDNF組MWT、TWL高于SNL、NS、AAV0各組（P ＜0.001）。BDNF+Furos組注射后各時間點MWT、TWL均低于BDNF、BDNF+NS組（P ＜0.001）。注射前后相應時間點SNL、NS、AAV0各組間比較差異無統計學意義。見表1、2。

表1 鞘內注射前后大鼠機械縮足反射閾值Tab.1 MWT in rats before and after intrathecal injection ±s

表1 鞘內注射前后大鼠機械縮足反射閾值Tab.1 MWT in rats before and after intrathecal injection ±s

注：與正常組比較，*P ＜0.001；與SNL、NS、AAV0 組比較，#P ＜0.001；與BDNF、BDNF+NS 組比較，δP ＜0.001

分組正常SNL NS AAV0 BDNF BDNF+Furos BDNF+NS注射前2 d 35.49±3.88 37.11±3.13 36.62±2.69 35.47±2.36 36.10±2.42 34.69±2.14 36.07±1.86 0 37.73±1.80 25.49±2.69*25.05±2.47*22.57±2.07*23.82±1.87*23.48±2.53*24.10±1.20*3 d 36.39±3.23 22.04±2.41*19.76±1.55*20.11±2.87*20.70±3.63*10.18±1.15*δ 20.98±3.17*7 d 36.41±1.97 17.47±2.17*17.76±2.73*19.32±1.25*20.52±3.14*11.03±1.54*δ 20.69±3.07*14 d 36.99±3.05 16.08±2.58*15.61±1.45*17.02±2.15*22.99±2.81*#17.99±1.77*δ 22.30±3.06*21 d 36.00±2.50 16.49±1.52*18.01±2.83*17.64±2.19*27.41±2.68*#21.31±3.32*δ 27.13±2.20*

表2 鞘內注射前后大鼠熱縮足反射潛伏期Tab.2 TWL in rats before and after intrathecal injection ±s

表2 鞘內注射前后大鼠熱縮足反射潛伏期Tab.2 TWL in rats before and after intrathecal injection ±s

注：與正常組比較，*P ＜0.001；與SNL、NS、AAV0 組比較，#P ＜0.001。與BDNF、BDNF+NS 組比較，δP ＜0.001

分組正常SNL NS AAV0 BDNF BDNF+Furos BDNF+NS注射前2 d 24.81±1.90 25.02±2.49 24.92±2.25 24.36±2.91 24.11±1.74 24.84±2.49 23.83±1.74 0 24.69±2.87 16.92±2.65*15.42±1.41*17.74±3.39*16.10±2.53*15.61±2.10*16.97±2.61*3 d 26.05±1.38 13.53±1.53*13.34±3.90*14.64±3.97*12.88±2.53*6.35±1.32*δ 13.09±2.38*7 d 24.47±2.86 9.10±2.64*9.18±1.43*10.69±1.36*10.85±2.00*6.87±1.40*δ 11.41±0.89*14 d 25.76±1.60 7.92±2.23*8.34±3.11*9.1±1.44*13.66±2.43*#7.95±1.09*δ 14.24±2.39*21 d 24.80±2.36 9.29±2.64*8.79±1.05*9.67±1.03*16.21±1.87*#7.82±0.82*δ 15.73±1.18*

2.2 注射后21 d 脊髓背角BDNF、KCC2 蛋白的表達情況正常組與SNL組比較，BDNF蛋白表達無明顯差異；BDNF組與正常組、SNL、NS、AAV0組相比，BDNF表達顯著升高（P ＜0.001）；BDNF+Furos組與BDNF、BDNF+NS組比較差異無統計學意義（圖1A）。造模各組與正常組比較，KCC2蛋白表達明顯下降（P ＜0.001）；與SNL、NS、AAV0相比，BDNF組KCC2表達明顯升高（P ＜0.001）；與BDNF、BDNF+NS組比較，BDNF+Furos組KCC2表達顯著下降（P ＜0.001，圖1B）。

3 討論

BDNF在正常狀態下，神經元細胞、肌肉、施旺細胞等可合成分泌一定量的BDNF，以維持神經元的存活和功能。當神經損傷時，BDNF參與了損傷神經的修復與保護［7］。IKEDA等［8］發現急性脊髓損傷后內源性BDNF在不同細胞內表達增加（包括運動神經元、感覺神經元、膠質細胞等），參與神經的修復，但表達量有限。本研究鞘內注射后21 d發現SNL組與正常組脊髓背角BDNF表達無明顯差異，表明損傷后內源性BDNF表達有限，不能滿足神經的修復保護。如果給予一定量的外源性BDNF是一種較好的途徑。有研究證實通過椎管內給予外源性BDNF［9］、或慢病毒緩慢釋放［10］、BDNF轉基因小鼠過表達［11］都可促進軸突的再生、神經的修復。

圖1 鞘內注射21 d 后脊髓背角內BDNF、KCC2 蛋白的表達Fig.1 Expression of BDNF and KCC2 protein in spinal dorsal horn at 21 d after intrathecal injection

神經的損傷伴隨神經病理痛的發生。多項研究表明，BDNF參與了神經病理痛的形成和維持。M′DAHOMA等［12］發現鞘內注射BDNF誘發的痛覺過敏和超敏反應與坐骨神經慢性壓迫性損傷引起的疼痛類似，可被BDNF?TrkB受體拮抗劑所阻止。CONSTANDIL等［13］也發現正常大鼠鞘內注射外源性BDNF可引起痛覺過敏，但無劑量依賴性、疊加性。UCHIDA等［14］通過部分坐骨神經結扎模型鞘內注射抗BDNF抗體，發現術后2 d注射鎮痛效果最佳，4 d后注射療效甚微，表明內源性BDNF在神經病理痛形成初期起了重要作用。而在疼痛發生的中后期，卻有研究發現BDNF可減輕疼痛。MA等［4］報道AAV介導的BDNF在海馬內的過表可緩解自發性疼痛，LIANG等［15］研究BDNF的過表達可以減輕脊髓損傷的炎癥反應，從而降低炎性疼痛。糖尿病周圍神經病變大鼠通過內源性或外源性BDNF增加，可以降低GRD神經元和K+離子通道興奮性，以緩解疼痛癥狀［16-17］。

可以看出，BDNF有修復、保護神經及止痛、致痛等多重作用，這可能與BDNF表達的時間與不同部位有關，即初期為疼痛的啟動因子，中后期更側重于修復鎮痛，特別是中樞神經系統。因此，本研究通過AAV介導的BDNF鞘內注射SNL大鼠與對照組、空白組比較，發現2周后大鼠機械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期逐漸升高，鞘內注射21 d時病毒載體穩定表達外源性BDNF，表明椎管內緩慢釋放外源性BDNF可以減輕異常性疼痛和神經痛的痛覺過敏，與以往報道一致［5］。

GABA抑制功能的下降是神經病理性疼痛發生的關鍵因素。其中抑制性中間神經元受體以GABAA為主。GABAA受體激活后開啟突觸后膜上的氯離子通道，使氯離子按照電?化學規律快速流入細胞，引起突觸后膜電位改變，從而形成抑制性效應。研究表明中樞抑制性功能（GABA）下調可引發自發性疼痛和痛覺過敏［18-19］。KCC2是陽離子?氯離子共轉運體家族中重要的一員，其能將細胞內氯離子泵出細胞外，造成胞外高氯，從而維持GABAA受體的抑制性功能［20］。神經損傷初期，BDNF激活TrkB通過級聯反應引起去磷酸化，細胞表面KCC2降解，導致KCC2活性下降，使抑制性神經元的功能低下，產生致痛作用［21］，表明BDNF在脊髓神經損傷早期是神經病理痛啟動因子之一。而當損傷進入亞急性期或慢性期，為了應對損傷，BDNF反而促進了KCC2表達上調，此作用可以被TrkB?Fc所阻止，同時損傷2周后注射外源性BDNF也可以上調KCC2的mRNA表達［22-23］。HUANG等［6］表明外源性BDNF由未損傷時的抑制逆轉為脊髓損傷后上調KCC2表達、恢復GABA激動劑的抑制作用產生鎮痛作用。本研究發現鞘內注射21 d BDNF組脊髓背角KCC2表達上調，而當鞘內同時注射KCC2抑制劑呋塞米后，BDNF+Furos組脊髓背角KCC2表達下調，痛域值顯著下降，說明損傷后期外源性BDNF的表達產生的鎮痛作用與KCC2的表達上調有關，而且此作用可以被KCC2抑制劑所阻止。這可能通過增加KCC2表達活性以維持細胞外高氯，進而維持GABAA受體的抑制性功能實現鎮痛。而BDNF是否影響GABA表達產生鎮痛需要進一步證實。

綜上，攜帶BDNF基因的AVV病毒鞘內緩慢的表達外源性BDNF可以起到鎮痛作用，這與KCC2上調有關。然而BDNF的作用機制復雜，在致痛、止痛、修復保護神經及神經再生都有表現，相關通路多為共用，這些功能的轉變尚不清楚，需要進一步研究解決。而如何控制基因表達及控制有效表達的問題仍需克服，過度表達是否會對無損傷神經產生影響則需進一步證實。